左归丸对糖皮质激素所致骨质疏松大鼠血清中E 2、P T H含量的影响*

李鸿泓，鞠大宏，滕静如，李 艳，刘 红，王少君，潘静华，于 峥，刘梅洁

左归丸是滋阴补肾法的代表方剂，出自明代温补名家张景岳的《景岳全书·新方八阵》，是张景岳由六味地黄丸化裁而来。我们以往的研究表明，其对卵巢切除所致的大鼠骨质疏松症有一定的治疗作用［1-3］。在以往研究工作的基础上，本研究建立大鼠糖皮质激素性骨质疏松模型，旨在对左归丸对糖皮质激素性骨质疏松症的治疗作用机理进行探讨。

1 材料与方法

1.1 动物

Wistar雌性大鼠 42只，体重200g～220g，清洁级，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供(实验动物许可证号 SCXK(军)2002-001)。大鼠在中国中医科学院中医基础理论研究所清洁级实验动物室内饲养(实验动物室许可证号SYK11-00-0039)。

1.2 药物

左归丸方药组成:熟地 24g，山药 12g，枸杞子12g，山萸肉 12g，牛膝 9g，莬丝子 12g，龟板胶 12g，鹿角胶12g。常规水煎制，含量为9.52g生药 /kg，给药浓度为0.952g/ml。地塞米松磷酸钠注射液:天津金耀氨基酸有限公司生产(批号0704031)，规格:1ml:5mg，使用时用生理盐水稀释至1mg/ml，给药体积 0.1ml/100g体重，给药剂量 0.1mg/100g体重。

1.3 试剂

大鼠血清雌二醇(E2)和甲状旁腺激素(PTH)ELISA试剂盒均购自美国ADL公司。戊巴比妥钠由北京通县育才精细化工厂生产(批号950427);盐酸四环素由欣惠泽奥科技有限公司提供(批号US22105);乙二胺四乙酸二钠(EDTA·Na2)由北京北化精细化学品有限责任公司生产(批号20060324);甲基丙烯酸甲酯由北京益利精细化学品有限公司生产(批号20050317);甲基丙烯酸丁酯由北京益利精细化学品有限公司生产(批号980716);聚乙二醇400由北京化学试剂公司生产(批号050425);苯甲酸甲酯由华北地区特种化学试剂开发中心(天津)生产(批号980923);过氧化苯甲酰由北京金龙化学试剂有限公司生产(批号20000420);N，N－二甲基对甲苯胺(N，N-Dimethylp-toluidine)由ALDRICH公司生产。Lot.:04327MB-235;Ⅰ液:100ml甲基丙烯酸甲酯 +35ml甲基丙烯酸丁酯+5ml苯甲酸甲酯 +1.2ml聚乙二醇400;Ⅱ液:Ⅰ液+0.4g干燥过氧化苯甲酰;Ⅲ液:Ⅱ液 +0.8g干燥过氧化苯甲酰。

1.4 仪器

冷冻切片机:英国 TBS公司;Reicheit-Jung2040切片机:德国;LEICA CTR6000显微镜:德国Leica公司;Leica-Qwin图像分析仪系统:德国Leica公司;酶标仪:美国 Thermo公司;洗板机:美国Thermo公司:恒温恒湿箱:上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.5 方法

1.5.1 动物分组及处理 将42只雌性 Wistar大鼠随机分为3组:空白对照组12只，模型组15只，左归丸组15只。模型组大鼠肌注地塞米松0.1ml/100g体重，给药浓度为 1mg/ml，给药剂量为1mg/kg体重，每周2次，连续8周;空白对照组则相应肌注等体积的生理盐水。左归丸组除按以上方法肌注地塞米松外，还灌胃给予左归丸水煎剂1ml/100g体重，给药浓度为 0.952g生药/ml，给药剂量为9.52g生药/kg体重，以上给药每天 1次，每周6d，连续8周。

各组大鼠于处死前16d和前3d分别腹腔注射盐酸四环素30mg/kg体重，以对骨进行荧光标记。给药结束后，采用大鼠麻醉后股动脉取血法，所取全血静置1h后，经2000rmp离心10min后取血清，－20℃冰箱保存用于ELISA检测。然后将各组大鼠迅速处死，取右侧胫骨制作不脱钙骨切片，用于骨组织形态计量学指标的检测。

1.5.2 骨组织形态计量学指标的测定 不脱钙骨切片的制作及染色:取大鼠右侧胫骨近端1/3，4%多聚甲醛溶液固定后用乙醇逐级脱水:80%、95%、100% 乙醇各2d，二甲苯透明2d。标本依次在塑料聚合液Ⅰ液、Ⅱ液、Ⅲ液中各浸泡3d。随后，将 400μlN，N-二甲基对甲苯胺 (N，N-Dimethyl-ptoluidine)加入到100ml预冷(4℃)Ⅲ液中，在青霉素小瓶中注入约7ml的Ⅲ液，将骨标本按同一方向放入瓶底用塞盖紧，用注射器抽空包埋瓶中空气，然后置于－20℃冰箱中聚合1周左右，变为无色透明的坚硬包埋块。修块后，每块个块切出5μm的纵向不脱钙骨切片各2张，其中1张甲苯胺蓝染色，另1张用于荧光观察。

骨组织形态计量方法:采用Leica-Qwin图像分析仪系统，对不脱钙骨切片进行形态计量。骨小梁体积百分比(TBV%):骨小梁体积占被测骨髓腔总体积的百分比，是衡量骨量水平的主要标志;骨小梁吸收表面百分比(TRS%):不规则﹑凹凸不平的骨小梁表面占骨小梁表面的百分比，它可判断破骨细胞的活性;骨小梁形成表面百分比(TFS%):有成骨细胞被覆的类骨质表面占骨小梁表面的百分比，它可判断成骨细胞的活性。

1.5.3 外周血血清中雌二醇(E2)和甲状旁腺激素(PTH)含量的检测 采用ELISA法检测血清E2和PTH的含量。具体步骤严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.6 统计学分析

实验结果皆以珋x±s表示，采用单因素方差分析(ANOVA)进行数据处理，组间两两比较，采用 q检验。

2 结果

2.1 左归丸对糖皮质激素所致骨质疏松大鼠骨组织形态计量学指标的影响

表1显示，模型组大鼠胫骨TBV%显著低于空白对照组，而左归丸组的TBV%则显著高于模型组，但与空白对照组相比仍有显著差异。与空白对照组比较，模型组大鼠胫骨 TRS%显著增高，而TFS%显著降低。左归丸组的TRS%与空白对照组相比显著增高，而TFS%明显降低;与模型组相比，左归丸组的 TRS%没有差异，但有明显降低趋势，TFS%则显著增高。

表1 各组大鼠胫骨TBV%、TRS%及TFS%的变化

2.2 左归丸对糖皮质激素所致骨质疏松大鼠血清中E2含量的影响

表2显示，模型组大鼠血清中E2的含量比空白对照组显著降低。左归丸组大鼠血清中E2的含量与模型组相比，显著增高，但较之空白对照组仍显著降低。

表2 各组大鼠血清中E2的含量

2.3 左归丸对糖皮质激素所致骨质疏松大鼠血清中PTH含量的影响

表3显示，模型组大鼠血清中PTH的含量比空白对照组显著增高。左归丸组大鼠血清中PTH的含量与模型组相比显著降低，但较之空白对照组仍明显增高。

表3 各组大鼠血清中PTH的含量

3 讨论

雌激素主要通过对成骨细胞和破骨细胞直接作用，调节成骨细胞分泌的局部细胞因子，加强降钙素的分泌，促进维生素D的合成，降低PTH对骨敏感性以及调节神经递质等环节对骨代谢产生影响。总之，雌激素可通过多靶点多环节对骨代谢进行调节，促进骨形成，抑制骨吸收［4］。而PTH对骨的主要作用是促进骨吸收，这主要是对破骨细胞的综合作用。其对破骨细胞的作用是间接增加破骨细胞中钙离子的数量，使破骨细胞数量增加，活性增强。同时，PTH持续分泌可以激活大量位于骨内膜中的骨原始细胞，使这些细胞加速分解并形成前破骨细胞和新破骨细胞，最终使破骨细胞的数量增多、活性增强，促进骨的吸收和溶解，使骨钙释放入血，提高血钙水平。

沈培芝等研究补肾方预防和治疗地塞米松致雄性大鼠骨质疏松的疗效。研究发现，预防组和治疗组大鼠的全身骨密度、股骨抗弯强度、血清睾酮水平均明显高于地塞米松组，而血清甲状旁腺素水平低于地塞米松组。说明应用补肾方可以提高性激素水平并降低血清甲状旁腺素水平，从而能够有效地预防治疗地塞米松诱导的雄性大鼠骨质疏松［5］。本实验的研究结果也证明了这一点。骨组织形态计量学结果显示，大鼠经连续大量使用糖皮质激素后，作为骨量主要标志的胫骨TBV%显著降低，代表骨吸收参数的 TRS%显著增高，而代表骨形成参数的TFS%降低，表明使用糖皮质激素所造成的是一种骨形成降低、骨吸收增加而骨吸收大于骨形成的骨质疏松模型。给大鼠灌服左归丸后，TBV%显著增高，TRS%与模型组相比虽无差异，但有明显的降低趋势，且TFS%明显增高。这一结果表明，左归丸能使糖皮质激素所致骨吸收增高和骨形成降低的骨量丢失状态得到控制和逆转，从而导致骨量的增加。实验还采用ELISA法检测了各组大鼠血清中E2和PTH的含量。结果显示，模型组大鼠血清中 E2的含量比空白对照组显著降低，而PTH的含量比空白对照组显著增高。左归丸组大鼠血清中E2的含量与模型组相比显著增高，而PTH含量显著降低。说明左归丸可以调节糖皮质激素所致的E2和PTH的紊乱状态，使之恢复到基本正常，这是其治疗糖皮质激素性骨质疏松症的作用机理之一。

总之，左归丸可通过调节血清中 PTH和E2的水平而达到治疗糖皮质激素性骨质疏松的目的，使PTH的水平下调，同时上调E2的水平，使其紊乱状态基本恢复正常。当然，左归丸治疗糖皮质激素性骨质疏松症的机理是非常复杂的，本实验只是对其中几个环节进行了探讨，其机理还有待于进一步的深入研究。

［1］ 刘梅洁，鞠大宏，赵宏艳，等.“肾主骨”的机理研究—左归丸含药血清对破骨细胞分化调控因子OPG、RANKL蛋白表达的影响.中国中医基础医学杂志，2009，15(3):184-187，196.

［2］ 鞠大宏，刘梅洁，赵宏艳，等.左归丸含药血清对成骨细胞OPG、RANKL mRNA表达的影响.北京中医药大学学报.

［3］ 鞠大宏，赵宏艳，刘梅洁，等.左归丸含药血清对成骨细胞 IL-1、IL-6和COX-2表达的影响.中国实验动物学报，2006，14(2):96-99.

［4］ 李 恩，等编著.骨质疏松鉴别诊断与治疗.北京:人民卫生出版社，2005.

［5］ 沈培芝，陈东煜，张 戈，等.补肾方防治地塞米松致雄性大鼠骨质疏松及其生化机制探讨.中国中西医结合杂志，1998，18(5):290-292.