脑清喷鼻微乳含药血清对PC12细胞损伤模型的保护作用*

陈 颖，陈英梅，祝维峰，郭洁文，杨 帆

缺血性脑卒中是由于脑血流供应障碍引起缺血、缺氧，导致局限性脑组织缺血性坏死或脑软化的疾病，而脑缺血再灌注损伤是引发多种脑血管疾病的重要病理生理机制，而有效的治疗方法为抗脑缺血再灌注损伤。我国使用中草药防治脑血管疾病由来已久，但是传统的中药口服给药途径很大程度上限制了中药疗效的充分发挥，尤其对中风吞咽困难或神志不清者，口服给药则更为困难。中药静脉注射液由于制剂工艺复杂，有效成分提取难度大，以致其品种和数量有限，难以满足临床需要。而传统的中医鼻药疗法，具有简便、实用、无创、安全、用药少、速效、高效的特点。脑清喷鼻微乳的处方是由广州市中医院祝维峰教授积多年临床经验研制出的治疗缺血性中风复方中药。本文应用血清药理学方法对脑清喷鼻微乳进行了研究［1］，采用谷氨酸和物理缺氧对PC12细胞进行损伤建立缺氧模型，比较微乳与传统水提制剂以及鼻腔与灌胃不同给药途径得出的血清对损伤细胞的保护作用。

1 材料与仪器

SD大鼠250g～300g，中山医科大学实验动物中心(合格证号 SCXK(粤)2008-0020，粤监证字2008A002);大鼠的肾上腺嗜铬瘤细胞(PC12细胞，中山医科大学实验动物中心);DMEM培养基(Gibco公司);胎牛血清(Gibco公司);胰酶(Amresco公司);谷氨酸(康龙生物有限公司);四甲基偶氮唑盐(MTT，Sigma公司);乳酸脱氢酶试剂盒(LDH试剂盒，南京建成生物工程研究所);脑清喷鼻微乳(自制，含生药 1g/ml);空白微乳(自制，Cremophor EL:乙醇:水=10:10:80);尼莫地平注射液(山东新华制药股份有限公司，批号0808176);其他试剂均为分析纯。

二氧化碳培养箱(Heraeus细胞培养箱);LEICA DFC420倒置显微镜(LEICA);M450型ELISA Reader酶标仪(美国Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 PC12细胞的培养

PC12细胞冻存于液氮中，用时进行复苏。培养液为DMEM培养液，含5%胎牛血清，用NaHCO3调至p H7.2左右。在37℃ 5%CO2饱和湿度培养箱中培养，待细胞长满培养瓶底后倒掉培养液，用PBS液轻轻荡洗1～2次，加入0.25%的胰蛋白酶液，消化2min～3 min吸弃消化液，加入 DMEM培养液终止消化，用吸管轻轻吹打，使细胞分散开，倒置显微镜下观察、计数。然后用DMEM培养液将细胞稀释为5×105个/ml的细胞悬液，接种于96孔培养板(100μl/孔)培养，待细胞长满单层即可用于实验。

2.2 含药血清的制备

健康SD大鼠30只，适应饲养1周，将动物随机分成10组。

灌胃给药组分为脑清喷鼻微乳高、中、低剂量组及水提液组和模型组。脑清喷鼻微乳高、中、低剂量组给药剂量分别为20、10、5 ml/kg，相当于临床给药剂量的15、7.5、3.8倍等效剂量;水提液组给药剂量为20 ml/kg，相当于临床给药剂量的7.5倍等效剂量;空白微乳对照组给予等体积的空白微乳;模型组给予等体积的生理盐水。灌胃给药，每日早晚各1次，间隔12h，连续给药3d。

鼻腔给药组分为脑清喷鼻微乳组，给药剂量为20ml/kg，相当于临床给药剂量的40倍等效剂量;水提液组给药剂量为20ml/kg，相当于临床给药剂量的40倍等效剂量;空白微乳对照组给予等体积的空白微乳;模型组给予等体积的生理盐水，8h持续给药。以上各组于末次给药1h后乙醚麻醉，颈动脉取全血，室温放置1h，离心10min(3000r/min)，小心分离血清，于56℃ 30min灭活，经0.22μm滤膜滤过除菌，－20℃保存。

2.3 分组与给药方法

将对数生长期的 PC12细胞以1×105/孔密度接种于96孔板，37℃ 5%CO2孵箱中培养24 h后，培养的PC12细胞分别处理:①正常对照组:DMEM培养基培养，不做损伤处理;②谷氨酸损伤模型组:在预处理的细胞中加入终浓度为20mmol/L的谷氨酸，继续培养 24h［2］;③缺氧复氧损伤组:将预处理的细胞置密闭玻璃干燥器中，真空泵抽真空(－0.01MPa)，保持抽取30min直至抽完培养基中的溶解氧，然后缓慢充入95%N2及5%CO2混合气，直至恢复正常气压(干燥器中放置气囊指示装置)，置37℃孵育12h取出，置37℃ 5%CO2培养箱中继续培养 12h，即缺氧 12h，复氧 12h［3］;④含药血清保护组:用2.2项下制备的8组含药血清，以10%含药血清预处理1 h后，分别进行②与③项的损伤处理，阳性对照尼莫地平组与空白微乳组平行进行②与③项的损伤处理，对各组细胞进行指标测定。

2.4 观察指标

2.4.1 细胞形态观察 将经过2.3处理的PC12细胞，置倒置显微镜下观察细胞形态。

2.4.2 MTT法检测细胞存活率 将经过2.3处理的PC12细胞，每孔加入MTT(5mg/ml)10μl，继续培养4h，吸弃上清，每孔加入DMSO150μl振荡10 min，溶解细胞中的蓝紫色结晶物，酶标仪测定490 nm波长处吸光度值(A值)，计算细胞存活率%=(实验组A值－空白对照组A值)/(对照组A值－空白对照组A值)×100%，重复实验3次。采用SPSS17.0 for Windows统计软件对所得的数据进行SNK-q检验方法处理。

2.4.3 乳酸脱氢酶(LDH)活性测定 经过2.3处理后，收集培养上清液，按试剂盒说明书测定乳酸脱氢酶(LDH)的活性，LDH漏出率按下式计算:LDH漏出率(%)=各组吸光值/模型组吸光值×100%。对所得数据进行统计学处理。

3 结果

3.1 细胞形态观察

图1显示，正常对照组 PC12细胞呈梭形或多角形，有小的短突起，细胞数量多。谷氨酸和物理缺氧损伤组细胞数量显著减少，大量细胞受损，细胞突起回缩，呈圆形，漂浮细胞较多。含药血清保护组细胞数量较多，且随着给药浓度的增加，细胞存活率趋高，接近正常对照组，细胞贴壁良好，形态正常，圆形及漂浮细胞减少，说明含药血清对PC12细胞的损伤有较好的保护作用。正常对照组、损伤组、含药血清保护组细胞形态见图1。

图1 显微镜下PC12细胞形态(×100)

3.2 MTT法检测细胞存活率

表1显示，脑清喷鼻微乳和传统水提液的含药血清对PC12细胞的谷氨酸和物理缺氧损伤模型都有保护作用。其中，灌胃给药3个剂量组的含药血清对损伤模型有明显的保护作用并呈现出剂量依赖性，而灌胃给药和鼻腔给药的含药血清对损伤模型的保护作用相当;而且无论是灌胃给药还是鼻腔给药，结果均显示脑清喷鼻微乳的含药血清比水提液的含药血清保护效果好(P＜0.05)。

表1 MTT法检测细胞存活率结果(珋x±s，n=3)

3.3 LDH的漏出量检测

表2显示，脑清喷鼻微乳和传统水提液的含药血清都抑制了细胞LDH的释放，说明对PC12细胞的谷氨酸和物理缺氧损伤模型都有保护作用。其中，灌胃给药3个剂量的含药血清对损伤模型有明显的保护作用并呈现出剂量依赖性，而灌胃给药和鼻腔给药的含药血清对损伤模型的保护作用相当;无论是灌胃给药还是鼻腔给药，结果都显示脑清喷鼻微乳的含药血清比水提液的含药血清保护效果好。

表2 LDH漏出量检测结果(珋x±s，n=3)

4 讨论

中药的研发主要是寻找药物的有效成分或有效部位，制备精良的中药制剂，提高临床疗效和降低毒副作用。血清药理学可以对有效药物或药物的有效成分进行初步筛选，还可以对药物的制剂工艺进行比较和筛选等。脑清喷鼻微乳方剂是以麝香、冰片芳香开窍为君，配伍石菖蒲、川芎、三七为臣，以加强麝香、冰片开窍醒神之效，并有行气活血、化痰息风之功。薄荷芳香走窜，载药上行为佐使，全方合用，量小力专，符合治疗缺血性中风病理机制与治疗要求，经过多年临床应用证明其疗效可靠。结合微乳本身固有的特殊结构将其制成的鼻腔给药制剂，可以增加药物的溶解度，促进药物吸收，提高药物的生物利用度，可为脑部疾病的治疗提供新给药途径。用含药血清代替煎剂或粗提物进行体外实验，克服了将中药复方制剂直接用于体外实验的缺点，通过依照制剂的临床给药途径获取的含药血清在体外的药理效应来反映药物在机体内的作用，提高了实验结果的可信性，能较客观和真实地阐明中药的药效和作用机理。

有关缺氧诱导凋亡模型的建立有较多文献报道。本实验采用谷氨酸和物理缺氧对PC12细胞进行损伤，建立缺氧模型。谷氨酸可通过多种机制引起神经细胞内钙超载，使神经细胞内钙失衡，引起神经细胞凋亡［4］。神经细胞内游离钙增多，可激活蛋白激酶和磷脂酶产生自由基，造成细胞损伤。国外很多报道证明，谷氨酸对PC12细胞的毒性包括氧化毒性［5、6］。另外，物理缺氧模型不改变细胞培养基成分的条件，更能真实模拟体内缺氧情况，更好地体现药物的保护作用。

MTT比色法是测定细胞活力常用的方法，MTT指标能反映细胞内的氧化还原状态，缺氧复氧组MTT值的下降是细胞内氧化压力上升的一种体现，并与出现的细胞死亡相关。细胞死亡或损伤时LDH释放至培养上清液中，上清液 LDH水平反映了细胞的损伤程度。PC12细胞缺氧复氧培养或谷氨酸诱导的PC12细胞损伤后，细胞活力明显下降，细胞损伤程度大;而应用含药血清预处理可明显增加细胞活力，细胞损伤程度明显降低。

本实验证明，大鼠给予不同剂量脑清喷鼻微乳所得的含药血清对缺氧复氧损伤模型有明显的保护作用并呈现出剂量依赖性，而微乳制剂比传统水提制剂的药效更好。MTT数据显示，灌胃3.8倍给药组保护作用最强，阳性对照尼莫地平组其次，微乳鼻腔给药组仅次于前二者。LDH数据显示，微乳鼻腔给药组与灌胃3.8倍给药组结果无统计学差异。实验结果进一步证实，脑清喷鼻微乳可经鼻黏膜吸收入血而发挥治疗作用，而且可避开首过效应，直接到达病灶发挥作用，为开发疗效好、不良反应少的缺血性脑中风天然药物新制剂奠定了基础。

［1］ Hiriko Iwama，Sakae Amagaya，Yukio Ogihara，et al.Effect of Shassaikoto.A Japanese and Chinese herbal medical mixture，on the mitogenic activing of lipopolysaccharide-a new pharmacological testing method.J Ethnopharmacol，1987，211:45.

［2］ 宋明旭，杨吉成，王蔚平.谷氨酸诱导的PC12细胞损伤的研究［J］.苏州科技学院学报，2006，23(1):62-65、76.

［3］ 臧林泉，苏兴文，邱鹏新，等.一种神经元体外缺氧诱导凋亡模型的建立［J］.中 国病理生理杂志，2007，23(6):1244-1245、1248.

［4］ Wu G，Fang Y Z，Yang S，et al.Glutathione metabolism and its implications for health［J］.J Nutr，2004，134(2):489-492.

［5］ Naqatu S.Apoptosis by death factor［J］.Cell，1997，88:355-365.

［6］ Penugonda S，Mare S， Goldstein G， et al. Effects of Nacetylcysteine amide(NACA)，a novel thiolantioxidant against glutamate-induced cytotoxicity in neuronal cell linePC12 ［J］.Brain Research，2005，1056(2):132-138.