快速老化小鼠SAMP8脑内神经病理学变化的研究进展

马芹颖 强 静 王铭维 (河北医科大学第一医院神经内科，河北 石家庄 05003)

快速老化小鼠(SAMP8)是由日本京都大学竹田俊男教授开发，以学习记忆功能呈增龄性加速衰退为主要特征，自从1986年Miyamoto等人首次报道了SAMP8小鼠的这一基本特征，之后成为了研究老化和学习记忆障碍的理想哺乳动物模型之一，为了阐明其中的神经生理学机制，人们进行了大量的研究。本文主要对SAMP8小鼠老化过程中神经病理学的研究进行了综述。

1 β淀粉样蛋白

β淀粉样蛋白(Aβ)是淀粉样前体蛋白(APP)的主要代谢产物，Aβ是AD病人脑内老年斑的主要成分，由39～42个氨基酸组成，分子量4.0 kD，三维结构呈β型折叠，具有强自聚性，极易形成难溶的沉淀，主要分为Aβ40和 Aβ42两种形式，Aβ42相对于Aβ40更易形成纤维，并早期选择性沉积于阿尔茨海默病(AD)脑中，可损害脑内与智力有关的特定结构。所以β淀粉样蛋白在脑内的异常沉积是AD发生的主要机制之一。

β淀粉样蛋白沉积在SAMP8小鼠脑内与人类AD的变化相似，但并不是完全相同的，这一变化最早由Takemura等人报道，由抗血清合成人的β/A41-24或β/A41-15肽段染色发现β/A4样免疫阳性颗粒结构(β-LIGS)。这些结构在不同脑区都能够发现包括中隔、大脑皮质、海马、小脑、某些颅神经核和神经根，并且随着年龄增长而数目不断增加。但这些团粒结构并不能被刚果红或者硫(代)黄素s染色显现。在Western印迹检测中，主要的阳性条带在14～18 kD之间，并且染色强度随年龄增长而增加。β-LIGS被认为不仅是小鼠老化的新的形态学证据，而且还是理解淀粉样蛋白沉积的合适线索。Fukunari等证实利用多克隆兔抗Aβ1-16进行组织化学染色能更早期的观察到β-LIGS。在SAMP8小鼠脑内β淀粉样蛋白免疫阳性区域与proryl endopeptidase-like免疫阳性区域相似提示二者的共区域化现象。Kumar〔1〕等报道利用酶联免疫吸附(ELISA)证实了4～12个月龄的SAMP8小鼠海马Aβ水平随年龄增加而增高。此外与Kumar在同一研究团队Morley等人〔2〕也描述了在21个月龄的SAMP8小鼠海马用小鼠抗人的Aβ抗体作为一抗进行免疫组化染色，可以观察到Aβ斑块。然而，在SAMP8小鼠脑内用刚果红或者硫(代)黄素S不能发现AD的标志老年斑样结构。最近，Jaume等人通过更为详细的研究进一步明确了从6个月开始，SAMP8小鼠海马内即有Aβ沉积，其数量和程度随年龄增加而逐渐增加，其沉积成分包括 Aβ40、Aβ42以及 APP〔3〕。

另外，免疫印记分析表明，淀粉样前体蛋白APP样蛋白在SAMP8小鼠也随增龄而增加，并且与胶质增生和GFAP表达增加有关。Morley等人报道SAMP8小鼠海马内有年龄相关的APP蛋白和RNA水平增高〔2〕。然而，在一项利用免疫细胞化学的研究中，在16个月的SAMP8小鼠海马内可以检测到Aβ斑块，但没有发现神经元的减少和凋亡。同样在APP转基因小鼠脑内也没有观察到神经元的减少〔4〕。这就提示，在SAMP8小鼠脑内可能存在着抗凋亡因素或者在AD发生时是其他病理因素引起了细胞凋亡而并非Aβ〔4〕。

由于多项研究均显示在SAMP8小鼠脑内有Aβ沉积，并且观察到随增龄逐渐增多，并认为与其认知功能下降有关，为了进一步证实这一观点，研究者们开始尝试给予SAMP8小鼠抗Aβ处理，并观察其认知功能。当SAMP8小鼠给予脑室内注射抗Aβ的反义寡核苷酸以后，在杏仁体、中隔以及海马的APP蛋白水平下降，蛋白质氧化以及脂质过氧化减低，并且可以观察到学习和记忆的下降有所改善〔5，6〕。并且抗Aβ抗体还可以通过静脉注射达到脑内发挥上述作用，但用量要比直接脑内注射大〔7〕。此外，在APP转基因以及SAMP8小鼠体内应用抗Aβ抗体的免疫疗法也可以导致Aβ沉积数量减少并可以逆转学习和记忆障碍〔7，8〕。

关于抗Aβ抗体的免疫疗效的机制也进行了探讨，Farr等观察到抗APP抗体可以增加老龄SAMP8小鼠海马的乙酰胆碱水平，所以胆碱能通路可能是其发挥作用的机制之一〔9〕。另外还有研究者认为抗APP蛋白Abeta区域的反义核苷酸以及抗Aβ抗体的治疗作用与减少老龄SAMP8小鼠脑内的氧化应激有关，可以减少脑内蛋白的氧化，降低氧化标志物的水平〔6，10〕。最近，Ali等给予SAMP8小鼠抗Aβ抗体或APP反义核苷酸治疗可以减少脑内Aβ沉积，改善认知功能，减少氧化应激。还发现这些治疗可以进一步提高老龄SAMP8小鼠一氧化碳合酶(NOS)的活性，提高诱导型NOS(iNOS)的mRNA水平，降低神经元内NOS mRNA和蛋白水平，但是并没有影响内皮型NOS(eNOS)或者iNOS的蛋白的水平，以及eNOS的mRNA水平，这就提示在SAMP8脑内Aβ和NOS之间有着复杂的关系，很可能是通过翻译后调节机制进行的〔11〕。

2 神经元纤维缠结(NFTs)和Tau蛋白的磷酸化

NFT也是AD的主要病理学特征之一，是导致神经元纤维退化的主要原因，可作为大脑早老化的标志，AD患者较正常老人脑内NFT数量更多、分布遍及整个大脑。在不同神经元中NFT有不同形态。NFT随AD的发展而增多，并与临床痴呆程度相关。NFT主要由双股螺旋细丝(PHFs)组成，而PHF的主要成分是高度磷酸化的tau蛋白。正常的tau蛋白是一种亲水性、可溶性、非折叠的微管相关蛋白，主要分布于成熟神经元的轴突，具有稳定神经元微管的作用，在维持神经元生长、保持神经元极性及胞内物质转运等方面起着重要的作用。

Canudas等报道5个月龄的SAMP8小鼠与同龄的SAMR1相比在皮质、纹状体、海马有Tau蛋白的高度磷酸化〔12〕。并且在SAMP8小鼠脑内也发现有α-突触核蛋白的表达水平增高〔13〕。α-突触核蛋白是在Tau蛋白高度磷酸化的过程中的一个强有力的诱导物质〔13，14〕。氧化应激被认为与α-突触核蛋白的浓度有直接关系〔15〕。由于SAMP8小鼠体内的抗氧化物酶的弱活性以及氧化状态的的高活性，异常Tau蛋白的磷酸化和α-突触核蛋白水平的提高可能部分是由于ROS的产生引起的〔13〕。另外与tau蛋白磷酸化的激酶也是研究的热点之一，糖原合成激酶-3β(GSK-3β)和周期素依赖性蛋白激酶5(Cdk-5)是Tau蛋白磷酸化过程中的关键酶，有研究者报道在老龄SAMP8小鼠脑内有Cdk-5水平增高，但GSK-3β水平没有相应增加〔12〕。Tajes等报道给予SAMP8小鼠锂剂在体内和体外均可减少细胞凋亡，并且减少Tau蛋白磷酸化过程中GSK-3β和CDK-5的水平，并且减少Tau蛋白在Ser199、Ser212和 Ser396位点的磷酸化〔16〕。Caballero等长期给予SAMP8小鼠饮水中加入褪黑素可以通过降低氧化应激水平而部分逆转Tau蛋白在Ser392位点磷酸化增加，减少 NFTs，降低 α-突触核蛋白表达〔17〕。

3 PGSs-PAS(过碘酸-希夫)阳性团块状结构

过碘酸-希夫(PAS)染色阳性的异常团粒状结构(PGSs)也在SAMP8小鼠脑内发现，与以上的病理变化相比，被认为是SAMP8小鼠特有的。PGSs的结构微小，呈圆形到卵圆形的均一质地，直径达到5 μm，经常聚集成群，与神经胶质酸性蛋白(GFAP)阳性的星形胶质细胞的突起位置很近。能观察到PGSs的脑区有海马、梨状皮质、嗅结节、斜方体的神经核以及小脑皮质。SAMP8小鼠海马内PGSs聚集体数量的定量分析发现其在3个月龄开始出现，6个月龄以后数目急剧增加。相反地是PGSs聚集体在对照的SAMR1小鼠老龄才会出现。年龄相关的颗粒聚集形成的聚集体在C57BL/6小鼠脑内也有报道，并且这些沉积物PAS染色呈阳性。类似的结构被认为在C57BL/6小鼠脑内也存在。用单克隆抗体进行免疫组化分析显示这些沉着物对硫肝蛋白糖抗体免疫反应阳性。然而，目前还不清楚在SAMP8小鼠脑内PGSs是否存在于神经元或者星形细胞的突起。

4 海绵体变性

海绵样变性首先由Yagi等人报道，是SAMP8小鼠脑内发现的最早的形态学变化之一。SAMP8小鼠脑内脑干网状结构的神经纤维内可以看到大小不等的空泡，而在发育过程中在SAMR1脑内则没有明显的空泡。退行性变发生在下丘脑到脊髓之间的水平，尤其是大细胞网状结构(MGRF)，桥脑网状结构，巨细胞网状神经核。空泡在1月龄开始出现，虽然随着年龄增长星形胶质细胞不断增生，在4～8月龄不论是数量还是体积都达到高峰。从超微结构上空泡可以分为2种形态。一种空泡在突触后成分内可以看到，在1月龄时树突内轻微膨胀，紧接着突触后结构中度膨胀，到2个月龄时树突内膜性结构扩大。在5月龄时可观察到髓鞘样膜薄片紧包在大空泡周围限制其扩大。另一种类型的空泡是因为在少突胶质细胞主要密集的区域髓鞘破裂而出现的。这一改变在2月龄开始出现，在5月龄很明显。空泡化的定量分析显示在MGRF空泡的面积和数量随年龄而增加，并且受到学习和记忆损害程度的影响。所以在被动回避反应中学习记忆能力随着在MGRF空泡化面积的扩大而不断恶化，并且提出假设MGRF(尤其是中部背侧)具有与学习记忆相关的功能。为了证实这一观点，对MGRF区域损伤的SAMR1小鼠进行了行为和记忆的测试。MGRF区域损伤的SAMR1小鼠与假手术组相比感觉阈值或者空旷地域活动没有差别，但被动回避行为严重退化并且有效回避能力受损。MGRF有与学习记忆相关的功能，并且是脑内学习记忆系统的一部分。网状结构的作用普遍认为是调节学习记忆过程以及保持清醒、注意力以及睡眠，所以可以假设网状结构损伤和学习记忆缺陷之间有病理生理关系。MHC-Ⅱ型阳性激活的小胶质细胞的增殖和聚集体形成在脑干的海绵样变区域也能观察到。这些激活的小胶质细胞在1或者2月龄开始出现，聚集体形成随着增龄逐渐加重。

5 其他

另外，SAMP8小鼠黑质的多巴胺能神经元以及蓝斑的去甲肾上腺素能神经元在老化过程中较SAMR1小鼠退行性变化更快，数量减少，免疫电镜下可以观察到SAMP8小鼠黑质致密部多巴胺能神经元线粒体肿胀、细胞核内陷，在纹状体的多巴胺能纤维内可以观察到降解空泡的聚集。

6 结论

综上，SAMP8小鼠脑内的神经病理学变化能够较好地模拟AD以及老化脑的病理变化，但又不是完全相同，总体来说SAMP8小鼠目前是研究年龄相关学习和记忆缺陷基本机制较好的动物模型，可广泛用于阐明学习记忆功能障碍的基本机制，研究老化相关性疾病，评价老化相关以及改善学习记忆功能的药物，是很好的研究工具。

1 Kumar VB，Farr SA，Flood JF，et al.Site-directed antisense oligonucleotide decreases the expression of amyloid precursor protein and reverses deficits in learning and memory in aged SAMP8 mice〔J〕.Peptides，2000;21(12):1769-75.

2 Morley JE，Kumar VB，Bernardo AE，et al.b-amyloid precursor polypeptide in SAMP8 mice affects learning and memory〔J〕.Peptides，2000;21(12):1761-7.

3 Jaume del Vallea，Joaquim Duran-Vilareguta，Gemma Manicha，et al.Early amyloid accumulation in the hippocampus of SAMP8 mice〔J〕.J Alzhei Dis，2010;19(4):1303-15.

4 Takeuchi A，Irizarry MC，Duff K，et al.Age-related amyloid beta deposition in transgenic mice overexpressing both Alzheimer mutant presenilin 1 and amyloid beta precursor protein Swedish mutant is not associated with global neuronal loss〔J〕.Am J Pathol，2000;157(1):331-9.

5 Kumar VB，Farr SA，Flood JF，et al.Site-directed antisense oligonucleotide decreases the expression of amyloid precursor protein and reverses deficits in learning and memory in aged SAMP8 mice〔J〕.Peptides，2000;21(12):1769-75.

6 Poon HF，Joshi G，Sultana R，et al.Antisense directed at the Abeta region of APP decreases brain oxidative markers in aged senescence accelerated mice〔J〕.Brain Res，2004;1018(1):86-96.

7 Banks WA，Farr SA，Morley JE，et al.Anti-amyloid beta protein antibody passage across the blood-brain barrier in the SAMP8 mouse model of Alzheimer's disease:an age-related selective uptake with reversal of learning impairment〔J〕.Exp Neurol，2007，206(2):248-56.

8 Wilcock DM，Alamed J，Gottschall PE，et al.Deglycosylated anti-amyloidbeta antibodies eliminate cognitive deficits and reduce parenchymal amyloid with minimal vascular consequences in aged amyloid precursor protein transgenic mice〔J〕.J Neurosci，2006;26(20):5340-6.

9 Farr SA，Banks WA，Uezu K，et al.Antibody to beta-amyloid protein increases acetylcholine in the hippocampus of 12 month SAMP8 male mice〔J〕.Life Sci，2003;73(5):555-62.

10 Poon HF，Farr SA，Banks WA，et al.Proteomic identification of less oxidized brain proteins in aged senescence-accelerated mice following administration of antisense oligonucleotide directed at the Abeta region of amyloid precursor protein〔J〕.Brain Res Mol Brain Res，2005;138(1):8-16.

11 Ali AK，Banks WA，Kumar VB，et al.Nitric oxide activity and isoenzyme expression in the senescence-accelerated mouse p8 model of Alzheimer's disease:effects of anti-amyloid antibody and antisense treatments〔J〕.J Gerontol A Biol Sci Med Sci，2009;64(10):1025-30.

12 Canudas AM，Gutierrez-Cuesta J，Rodríguez MI，et al.Hyperphosphorylation of microtubule-associated protein tau in senescence-accelerated mouse(SAM) 〔J〕.Mech Ageing Dev，2005;126(12):1300-4.

13 Alvarez-García O，Vega-Naredo I，Sierra V，et al.Elevated oxidative stress in the brain of senescence-accelerated mice at 5 months of age〔J〕.Biogerontology，2006;7(1):43-52.

14 Frasier M，Walzer M，McCarthy L，et al.Tau phosphorylation increases in symptomatic mice overexpressing A30P alpha-synuclein〔J〕.Exp Neurol，2005;192(2):274-87.

15 Shendelman S，Jonason A，Martinat C，et al.DJ-1 is a redox-dependent molecular chaperone that inhibits alpha-synuclein aggregate formation〔J〕.PLoS Biol，2004;2(11):e362.

16 Tajes M，Gutierrez-Cuesta J，Folch J，et al.Lithium treatment decreases activities of tau kinases in a murine model of senescence〔J〕.J Neuropathol Exp Neurol，2008;67(6):612-23.

17 Caballero B，Vega-Naredo I，Sierra V，et al.Favorable effects of a prolonged treatment with melatonin on the level of oxidative damage and neurodegeneration in senescence-accelerated mice〔J〕.J Pineal Res，2008;45(3):302-11.