细胞信号转导通路与动脉粥样硬化的研究进展

杨雪佳 王高频 (辽宁医学院附属第一医院心内科,辽宁 锦州 121001)

动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是由单核/淋巴细胞黏附并激活内皮细胞(EC)而开启的由多种原因导致的疾病〔1〕,是冠状动脉疾病、周围动脉疾病、脑梗死等血管性疾病的病理基础。不同细胞因子发挥生物学功能均是通过与细胞膜表面受体相互作用,经过跨膜信号转导活化细胞内的相关信号通路,最终促进靶基因的表达。介导细胞因子生物学活性的信号通路在 AS的发生、发展中具有重要作用,目前人们已经对 AS形成中的相关信号通路的作用进行了广泛研究,并针对相关信号通路而采取的新型治疗方法取得了重大的进展。

1 炎症相关信号通路与AS

在 AS病变发生发展过程中,从脂质条纹到纤维斑块和粥样斑块,乃至不稳定斑块的形成和破裂,始终都有各种炎症细胞和大量的炎症介质参与,存在变质、渗出和增生。各种危险因素损伤血管内皮,上调产生单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF),趋化募集并增殖单核/巨噬细胞。同时分泌的各种细胞黏附分子促进血小板、粒细胞、单核细胞等黏附于血管内皮,释放多种生物活性因子,触发启动炎症反应,促成 AS病变的发生和发展。核转录因子-κB(NF-κB)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)及 Janus激酶-信号转导转录激活因子(JAK-STAT)是细胞内 3条重要信号通路。

1.1 NF-κB信号通路 NF-κB是由 Rel蛋白家族的成员以同源或异二聚体形式组成。目前发现的哺乳动物的 Rel蛋白包括 Rel A(p65、NF-κB3)、Rel(c-Rel)、RelB、NF-κB1(p50)和 NF-κB2(p 52),结构上它们的 N端都具有一个由 300个氨基酸组成的Rel同源区,该区域含有二聚体化区,DNA结合区和核定位信号区,分别具有与同源或异源亚基形成二聚体、与DNA上的 κB序列结合、与 κB抑制蛋白(IκB)家族成员相互结合等功能。NF-κB是促炎细胞因子激活细胞的主要信号通路之一。静息状态下,NF-κB的 p65亚基与 IκB单体结合形成的三聚体复合物以失活状态存在于细胞质中,不具有调节基因转录的能力〔2,3〕。当细胞受到如应激、病原体、细胞因子、生长因子等的作用时,①IκB激酶(IKK)α/β/γ复合物被 MAPK家族,及非典型蛋白激酶(aPKC)和蛋白激酶 B(Akt)激活;②IκB在酪蛋白激酶 II的作用下磷酸化,其 C末端富含脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)及苏氨酸(T)(PEST)结构域,然后对 IκBαN端的 32和 36位的丝氨酸进行磷酸化;③IκB N端第 21和 22位赖氨酸与多个泛素分子共价结合;④与泛素结合的IκB发生构象改变被多催化性 ATP依赖性 26S的蛋白酶识别并降解,NF-κB游离并移入核内,启动相关基因的转录。由于 NF-κB与IκB亲和力大于与其 DNA的亲和力,在核内与新合成的 IκB结合,使其从 DNA上解离下来,然后在 IκB分子中的核输出序列作用下促使 NF-κB重新回到细胞质中〔4〕。 NF-κB活化与失活的循环调控,维持了细胞内环境稳定。

研究发现,活化的 NF-κB存在于AS病灶的平滑肌细胞(SMC)、巨噬细胞、EC等多种细胞中。这条通路激活后可以调节编码促炎细胞因子、黏附分子、趋化因子、生长因子以及环氧合酶-2(COX-2)和诱导型一氧化氮合酶(NOS)等基因的表达。通过大规模的临床研究表明,在NF-κB高度表达的主动脉 AS患者中,主动脉处于超炎症状态。因此,NF-κB高度表达的诊断参数提供了一种炎症依据,证明可能导致AS〔5〕。给予低密度脂蛋白受体基因(LDLR-/-)小鼠高脂饮食后,研究者们早期即可在其主动脉根部发现内皮细胞内 NF-κB的活化,而该部位在接下来的观察中将发展成为 AS斑块〔6〕。Edwin Kanters等研究发现同样给予高脂饮食,利用新型的鼠单克隆抗体,在NF-κB1表达缺陷的小鼠比对照组 AS的发生率低〔7〕。

1.2 MAPK细胞内信号转导通路 MAPK是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,它广泛存在于体内大多数细胞内,对细胞的增殖、分化、凋亡及应激反应具有至关重要的作用。真核细胞中,已确定出细胞外信号调节激酶(ERK)(P42/P44MARK)通路、应激活化蛋白激酶(SAPK)/JNK通路、P38MAPK通路及 ERK5通路 4条MAPK信号转导通路。其中 ERK1/2通路可被多肽生长因子和佛波酯激活,对机械刺激也可作出反应。JNK和P38通路对生长因子和佛波酯反应微弱,但对炎症因子,应激刺激如高温、渗透压变化、紫外线、DNA损伤剂和蛋白合成抑制剂反应强烈,因此又被称为 SAPK。已知ERK5通路可被生长因子、氧化应激、高渗刺激等因素激活,但对其上游的信号分子及其激活后产生的生物学效应不是很清楚。这 4条通路在胞内都是经 MAPKKK,MAPKK和MAPK3级级联反应将信号传至核内,作用于特定的靶基因,发挥生物学效应。

有实验表明,与载脂蛋白 E-/-小鼠比较,JNK 2缺失的载脂蛋白 E-/-小鼠 AS损害明显减少。将载脂蛋白 E-/-JNK 2-/-小鼠的骨髓移植到载脂蛋白 E-/-小鼠体内时,该小鼠的 AS损伤将一定程度减轻〔8〕。Lu等发现 MAPK信号通路的下游盘状结构域(DDR)1受体,在AS血管损伤的平滑肌细胞中表达增加,I型胶原诱导 SMC迁移是通过 DDR1受体信号介导的〔9〕。有实验证明褪黑素能降低由氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的高脂血症模型人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中 MLCK的表达与活性,可能与信号调节通过ERK/MAPK信号转导通路降低了 AS斑块形成相关〔10〕。

1.3 JAK-STAT和转导子信号通路 JAK是一类非受体型酪氨酸激酶,由 4个成员组成:JAK 1、JAK2、TYK2和 JAK 3。前 3者广泛存在于各种组织和细胞中,而JAK3仅存在于骨髓和淋巴系统。它们分别参与干扰素 α、β、γ和白细胞介素 3～6、粒-巨细胞集落刺激因子等细胞因子的信号转导过程,具有高度的保守性,是一条细胞因子对免疫反应、血细胞生成、神经和胚胎发育的调节以及细胞增殖凋亡等多效性的传导通路〔11〕。JAK的酪氨酸磷酸化底物是STATs家族成员。在哺乳动物细胞中,STATs家族可以分为七个亚型 STATl、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和 STAT6〔12〕。 STAT的 C末端转录激活结构域在各个亚型中存在着较大的差异,这与不同类型的细胞因子激活下游不同亚型的 STAT从而激活不同基因有关〔13〕。

STAT3作为 JAK/STAT信号转导途径中的一个重要的信号分子,IL-6可以结合 IL-6受体的 α-链和糖蛋白 130(GB 130),而后激活 JAK1和 STAT3。干扰素(IFN)-α激活JAK1和 JAK2后通常再激活 STAT蛋白〔14〕。 IFN-γ是一种免疫调节和抗菌因子,Hao等〔15〕研究表明,IFN-γ可以使 ABCA 1表达增多,可能首先是通过JAK/STAT1信号传导途径上调肝X受体-α表达,并降低胆固醇,从而减少 AS发生中泡沫细胞的形成。Ievy和 Granot〔16〕报道,STAT3通过直接对早期反应基因的转录激活,从而调控 VSMC中增殖信号的传递,而大鼠颈动脉球囊损伤后早期即出现 JAK 2及 STAT3的诱导性增高,并在术后 7 d达到峰值。

2 泛素-蛋白酶体通路(ubiquitin-proteasome system,UPS)与 AS

UPS广泛存在于真核生物细胞中,由泛素(Ub)、泛素活化酶(E1)、泛素耦联酶(E2s)、泛素-蛋白连接酶(E3s)、26 S蛋白酶体以及泛素再循环酶等组成〔17〕。UPS是 ATP依赖性的,非溶酶体蛋白质的降解通路,不仅降解变性、异常或起短暂作用的蛋白质,而且能降解转录因子、内膜蛋白和细胞周期蛋白等天然蛋白质。UPS在维持蛋白质稳定状态、调节细胞程序性死亡和控制细胞周期等过程中起重要作用。研究发现,细胞内80%～90%的蛋白质是由UPS来降解的,因此,UPS被认为是细胞内蛋白质降解的主要通路,对维持细胞及整个生物体的正常功能,起着重要的作用〔18〕。

Herrmann等〔19〕发现急性冠状动脉综合征患者不稳定斑块内泛素与 T细胞共同表达,影响后者功能,参与炎症反应并改变斑块稳定性。泛素耦联酶-9参与 Fas下游信号转导并介导细胞凋亡。Marfella等〔20〕发现晨起血压对 AS稳定性的影响是通过 UPS发挥作用。Marfella等〔21〕还发现 AS患者泛素水平升高但蛋白酶活性减低,UPS功能减低促进细胞老化,加速 AS进程。Yamada等〔22〕对进行过主动脉及二尖瓣手术的 60名患者(平均年龄 64.5岁)进行调查分析,Ub和巨噬细胞易出现在有瓣膜疾病患者的心瓣膜上,而且UPS还可以通过炎性过程以促进 AS的发生。

3 Wnt信号通路与AS

Wnt蛋白是一组富含半胱氨酸的糖基化蛋白,参与细胞的增殖、分化、凋亡以及控制细胞的定位等过程,而且在无脊椎和脊椎动物心脏发育过程中也起到关键作用。在胚胎发育期,Wnt信号的失调将会导致夭折或发育缺陷,在成体中则会导致包括癌症在内的多种疾病的发生〔23〕。

Wnt信号通路是一条繁杂的信号网络,目前的研究认为至少有 3个分支:①经典 Wnt通路;②Wnt/细胞信号极性(PCP)通路;③Wnt/钙离子通路。在一项对阻止AS进展策略研究中,证实经典 Wnt信号通路增强单核-内皮细胞粘附而没有改变粘附分子的表达水平〔24〕。周细胞(pericytes)是主要的内皮支持细胞〔25〕,紧靠 EC,它有调控 EC的成熟、稳定微血管壁及促进新生血管和血管出芽等功能。周细胞沿着脂肪生成、软骨生成和骨生成方向的异常分化与AS和血管钙化有关。Wnt信号抑制周细胞向脂肪系分化而促进其向软骨系分化。提示 Wnt信号通路可能与 AS的发生有关〔26〕。研究者已在载脂蛋白 E基因缺陷小鼠和接受动脉内膜切除术的病人的颈动脉内膜下发现大量 Wnt5a在巨噬细胞积累的区域,同时也发现了大量 Toll样受体 4(TLR-4)。定量 RT-PCR检测显示,内毒素脂多糖(LPS)(已知的TLR-4配体诱发)刺激某种巨噬细胞而使 Wnt5a的mRNA表达。这些都证明Wnt5a在人类和小鼠AS病变中有表达〔27〕。

4 Rho/Rho激酶信号通路与AS

早在 1985年,Rho被确认为是 Ras的哺乳动物基因同系物并因此而得名(Ras homologue)。它广泛分布于哺乳动物的组织细胞中,被称为小G蛋白超家族,并因具有 GTP酶活性,又称为 RhoGTP酶,是目前研究最为详细的 Ras相关单体 GTP酶。RhoGTP酶有与 GDP结合或 GTP结合的两种失活或激活状态,前者定位在细胞浆内,而后者与细胞膜相结合,在细胞的信号转导通路中作为信号转换器或分子开关,作用于细胞骨架或其靶蛋白而产生多种生物效应。

现已证实 Rho的下游靶效应分子有 70多个,Rho激酶(ROCK)是其最主要和最直接的效应分子,ROCK又称Rho相关激酶,属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是目前功能研究最为详细的Rho下游靶效应分子。ROCK参与 AS发病机制的途径如下:①促进单核细胞内皮下迁移:在单核细胞穿越内皮细胞层的迁移过程中,需要发生形态及黏附力的变化。ROCK主要减弱单核细胞尾部整合蛋白调节的黏附力,从而促进胞尾收缩及增强穿越内皮细胞的能力〔28〕。②促进纤溶酶原激活剂抑制物-1(PAI-1)的表达:在鼠离体平滑肌细胞实验中,抑制 ROCK的活性可完全抑制 AS诱导的平滑肌细胞 PAI-1mRNA的表达,但并不影响 ERK的激活。ROCK可能通过活化转录因子,包括活化蛋白-1及血清反应因子等来调节 PAI-1的表达〔29〕。③ROCK增强 EC的通透性:应用ROCK抑制剂 Y-27632,可明显抑制 EC的通透性。ox-LDL,溶血磷脂酸,凝血酶激活 ROCK,因而抑制了肌球蛋白磷酸化酶的活性,增加了肌球蛋白轻链(MLC)的磷酸化,导致 EC收缩,通透性增加〔30〕。④ROCK促进SMC增殖:血管中膜SMC迁移与增生是 AS的基本病理改变之一。ROCK参与凝血酶诱导的SMC的 DNA的合成及迁移〔31〕。ROCK也参与hu-2诱导的血管 SMC增生〔32〕。这种作用可能是通过向下调节细胞周期蛋白依赖的激酶抑制剂P27KIP1而实现的。

ROCK参与的SMC对Ca2+增敏的调节在平滑肌收缩中占主要地位。其机制可能为 Rho活化 ROCK,ROCK抑制肌球蛋白磷酸化酶的活性,提高了磷酸化的肌球蛋白轻链(MLCK)磷酸化水平,使平滑肌收缩,导致冠状动脉痉挛。Mori-Kawabe等〔33〕发现异丙肾上腺素可以使 apoE基因敲除小鼠的内皮完整的主动脉强烈收缩,Y-27632可以更有效地降低了 apoE基因敲除小鼠的收缩性,这提示AS形成早期的平滑肌收缩更多的依赖于 ROCK活性,与 Rho/ROCK系统有重要联系。ROCK参与如平滑肌收缩,细胞迁移和增殖的多种细胞功能。在过去几年中,Zhou等〔34〕研究证实,他汀类药物可通过抑制 ROCKs及其下游目标 Rho激酶而对血管起保护作用,减轻血管的炎性反应,并通过对 AS的“多效性”以减缓 AS的发生。

5 展 望

细胞信号转导通路的研究是探讨人类疾病机制最富有成果的领域,多项试验证明AS有复杂的炎症病理生理基础,最近几年,在阐明AS的细胞内信号转导机制方面取得了很大进展。但是各种信号通路详细机制尚有待进一步研究。细胞因子在AS的临床早期诊断、血管事件风险评估、治疗中的应用已初现端倪,而靶向于细胞因子及细胞内信号转导的抗 AS治疗方法直接针对疾病的慢性炎症本质,因而具有良好的应用前景。

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