G-CSF干预对老龄慢性脑缺血大鼠模型认知改善与胶质细胞可塑性的影响

舒细记 柳 威 周红艳 陈 莹 陈艳华 熊巍鹏 艾永循

(江汉大学医学院病理学与病理生理学教研室,湖北 武汉 430056)

慢性脑血管疾病是人类非自然死亡和致残的主要原因之一,慢性脑缺血是多种老年慢性脑血管疾病的共同病理过程,可致中枢神经细胞缺失与功能障碍〔1,2〕。粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor,G-CSF)作为骨髓干细胞的动员剂,可动员外周血骨髓干细胞向中枢神经系统迁移,分化成神经细胞和胶质细胞,促进中枢神经系统损伤的修复。目前已有 G-CSF干预急性脑缺血〔3,4〕或局灶性脑缺血〔5,6〕损伤后神经细胞再生的相关研究,但针对慢性脑缺血损伤后胶质细胞可塑性的研究未见报道。本研究通过构建慢性脑缺血老龄鼠模型,从认知功能改善和星形胶质细胞可塑性改变的角度,探讨G-CSF对老龄鼠海马慢性脑缺血损伤的神经修复作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性 SD大鼠 35只,鼠龄 12个月,体重(360±45)g,由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供。构模后符合实验设计要求的15个月老龄鼠有 27只。

1.2 药物及试剂 重组人粒细胞集落刺激因子(商品名瑞白)齐鲁制药有限公司产品;胶质纤维酸性蛋白(GFAP)单克隆抗体,Maxim Biotech公司产品;二步法免疫组织化学检测试剂盒,PV-9000,GBI公司产品。

1.3 慢性脑缺血模型的建立与实验分组 采用 1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(35～40 mg/kg),分离并永久结扎双侧颈总动脉(two-vessel occlusion,2VO),构建 2VO模型。假手术组(Sham)方法同上,仅分离但不结扎 2VO作为对照。将行 2VO术及 Sham组大鼠术后饲养 3个月。符合实验设计要求(2VO、术后存活 3个月以上,即鼠龄 15个月以上)的 2VO模型鼠 17只,分为 2VO/G-CSF组 (10只)、2VO/生理盐水(NS)组 (7只)。Sham组大鼠存活 10只。G-CSF干预剂量为 10μg/kg,NS的安慰剂量约为 0.1 ml/只(对照组 NS的剂量尽量与治疗组使用 G-CSF的容积一致),均皮下注射,连续 3d,停药 5d,完成水迷宫实验后立即处死大鼠,取材制作组织切片。

1.4 学习记忆能力评估 水迷宫实验采用成都泰盟MT-200 Morris水迷宫视频跟踪系统。其中,定位航行实验评估其空间学习能力,空间探索实验评估其空间记忆能力。适应性训练:正式实验前1 d大鼠在无逃逸平台的水池中适应性游泳2 min。定位航行实验:连续 5 d,每日上午将大鼠面向池壁从不同象限入水,找到平台后站立 15 s,记录其找到隐匿平台所耗的逃逸时间,再从平台上移开休息 60 s后进行下一轮实验。如果大鼠在 120 s内未找到平台,在操作者的引导下上平台,逃逸时间记为 120 s。空间探索实验:完成定位航行实验后撤去平台,将大鼠从平台所在的对面象限中放入水池,记录 2 min内大鼠穿过平台所在区域的次数及停留于平台所在象限的时间。

1.5 组织病理学检查与图像分析 4%多聚甲醛全身灌注固定,海马取材定位于前囟后 3.7 mm处,取含海马组织制片,苏木素-伊红(HE)染色。免疫组化染色。采用即用型 GFAP抗体及 PV-9000试剂盒完成,设 PBS为阴性对照,已知阳性切片为阳性对照,GFAP以细胞质出现棕色颗粒为阳性。免疫荧光染色取同部位的相邻切片,采用 Hoechst 33258染色液室温下染色,凋亡细胞以细胞核呈致密蓝染颗粒为准。采用MOTIC公司 Med 6.0系统进行图像分析。全部样本在 40倍视野选取目标区域 CA 1区,再在高倍镜下(400倍)随机选定起始区后连续采集 5个高倍视野,每个视野选取 10个胞质突起完整的 GFAP阳性细胞,用标准网格记录GFAP阳性细胞数,同时,每个待测细胞取最长的一个胞质突起,记录其测量长度(μm)。

1.6 统计学分析 采用 SPSS13.0及 Excel2003软件,数值以±s表示。定位航行实验数据采用重复测量数据方差分析的最小显著差(LSD)法进行组间比较,其他数据采用单因素方差分析,空间记忆功能与星形胶质细胞可塑性的相关性分析采用Pearson法。

2 结 果

2.1 常规病理组织学观察 相对于 Sham组,2VO/NS组老龄鼠海马 CA 1区锥体细胞排列稀疏而紊乱,GFAP阳性细胞胞质突起分支少而短小,部分胞质突起崩解消失,毛细血管壁附近有较多的 GFAP阳性细胞突起。相对于 2VO/NS组,2VO/GCSF组锥体细胞胞体增大,胞浆丰富,细胞排列层数增多,而GFAP阳性细胞的胞质突起明显纤长,分支增多。

2.2 GFAP阳性细胞数量的变化 海马 CA 1区 GFAP阳性细胞 2VO/NS组(25.53±7.17)显著少于 Sham组(63.79±11.57),两者的差异有统计学意义(F=7.93,P＜0.05);显示2VO老龄鼠模型中存在慢性脑缺血损伤。海马CA1区 GFAP阳性细胞 2VO/G-CSF组(36.47±6.21)明显多于 2VO/NS组,两者的差异有统计学意义(F=6.21,P＜0.05)。

2.3 GFAP阳性细胞胞质突起的变化 2VO/NS组海马 CA1区 GFAP阳性细胞的胞质突起明显缩短、分支减少,平均长度(157.43±19.27)μm,明 显 短 于 Sham组 〔(243.31±53.34)μm〕,差异有统计学意义(F=9.68,P＜0.05)。2VO/GCSF组 GFAP阳性细胞的胞质突起分支多而纤长,平均长度(189.11±37.01)μm,明显长于 2VO/NS组,差异有统计学意义(F=7.82,P＜0.05)。

2.4 G-CSF对老龄缺血大鼠认知功能的干预作用 定位航行实验发现,随着训练次数的增加,各组大鼠找到隐匿平台的逃逸时间呈逐渐缩短的趋势。2VO/NS组的逃逸时间高于 Sham组(F=72.58,P＜0.01)。2VO/G-CSF组逃逸时间显著低于2VO/NS组(F=153.40,P＜0.01)。空间探索实验发现,2VO/NS组大鼠停留于平台所在象限的时间(8.90±4.51)s低于Sham组(15.63±4.35)s(P＜0.05);2VO/NS组大鼠跨越平台所在区域的次数(3.55±1.07)少于 Sham组(8.77±3.64)(P＜0.01)。2VO/G-CSF组大鼠停留于平台所在象限的时间(15.35±4.21)s高于 2VO/NS组(P＜0.01);2VO/G-CSF组大鼠跨越平台次数(8.52±2.68)明显多于 2VO/NS组(P＜0.01)。见表 1。

表1 各组大鼠定位航行的逃逸时间(±s,s)

与 Sham组比较:1)P＜0.01;与 2VO/NS组比较:2)P＜0.05,3)P＜0.01

组别 n 第1天 第 2天 第3天 第 4天 第5天Sham组 10 66.12±7.33 45.08±6.91 31.07±5.26 22.15±3.53 16.03±2.29 2VO/NS组 7 94.98±14.751) 78.52±13.111) 64.95±11.381) 43.05±4.371) 29.17±1.631)2VO/G-CSF组 10 81.53±8.092) 54.24±9.033) 43.93±7.083) 29.03±4.813) 19.55±2.463)

2.5 老龄缺血大鼠认知功能改善与胶质细胞可塑性的相关性分析 2VO/NS组、2VO/G-CSF组、Sham组的空间记忆改善趋势与对应的胶质细胞可塑性变化的相关性分析显示:各组海马CA1区 GFAP阳性细胞胞质突起的长度变化与各组对应停留时间的变化趋势(R=0.697,F=0.645,P＜0.05)、穿过平台区域次数的变化趋势(R=0.624,F=0.619,P＜0.05)均呈正相关;各组老龄缺血大鼠海马 CA 1区 GFAP阳性细胞的数量变化与对应的停留于平台所在象限的时间变化趋势(R=0.711,F=7.593,P＜0.05)、穿过平台区域的次数变化趋势(R=0.731,F=8.754,P＜0.05)呈正相关。提示海马胶质细胞可塑性与空间记忆能力改善密切相关。

3 讨 论

2VO是慢性脑缺血的理想模型,2VO可致大脑持续性低血流灌注,但脑组织未见明显的坏死区,也未见明显的运动功能障碍,如肢体瘫痪等中枢运动神经系统损伤症状,与人类慢性脑缺血的病理过程相似〔7〕。慢性脑缺血类疾病多好发于老年人,本研究对 12月龄大鼠开始 2VO手术,持续低血流灌注 3个月,实际观察分析时已是 15月龄的 2VO老龄鼠。以往研究构建的脑缺血模型较少考虑年龄对缺血损伤的影响,本实验模型与临床症状较为吻合。G-CSF对于造血细胞的生长和分化起重要介导作用,具有刺激骨髓干细胞增殖、分化、成熟以及介导细胞毒作用、趋化作用等生物学功能。海马与学习记忆密切相关,是脑缺血损伤最敏感的区域之一,其损伤可以导致学习记忆等认知功能障碍。

本研究在行为学层面,通过定位航行实验发现,G-CSF干预后慢性脑缺血大鼠的逃逸时间显著缩短,空间学习能力明显改善。空间探索实验发现,G-CSF干预后慢性脑缺血大鼠停留于平台所在象限的时间及跨越平台次数均显著增多,空间记忆能力明显改善。提示G-CSF可有效改善慢性脑缺血所致的认知功能障碍。在病理组织学层面,就海马锥体细胞增生而言,本研究发现 G-CSF干预后海马CA 1区锥体细胞胞体增大,胞浆丰富,细胞排列层数明显增多。就海马胶质细胞可塑性而言,星形胶质细胞(GFAP为其特异性分子标记物)为海马区最主要的胶质细胞,星形胶质细胞具有通过改变自身特性适应损伤刺激的能力,即可塑性,其表型上的可变性包括:细胞数量上的增加,细胞胞体、胞核大小及突起长度的变化,其中以胞质突起长度变化最为明显〔8,9〕。本研究中 Sham组 GFAP阳性细胞数量最多、胞质突起长度最长,2VO/G-CSF组次之,2VO/NS组最次(部分GFAP阳性细胞胞质突起甚至崩解)。Sham组与 2VO/NS组、2VO/G-CSF组与 2VO/NS组的 GFAP阳性细胞数量及胞质突起长度的组间分析,前者提示慢性脑缺血对海马区星形胶质细胞的损伤作用,后者提示G-CSF可有效促进海马区星形胶质细胞的可塑性变化。本研究对 G-CSF干预后空间记忆改善与胶质细胞可塑性进行相关性分析,发现大鼠停留于平台所在象限的时间、穿过平台区域的次数与海马 GFAP阳性细胞的数量及其胞质突起长度均呈正相关,进一步提示,G-CSF干预后的星形胶质细胞可塑性变化与认知改善密切相关。

认知障碍改善主要在于海马神经细胞和胶质细胞的修复。本研究中 G-CSF干预后星形胶质细胞数量增加,胞体增大,胞质突起长度增加、分支增多。新生星形胶质细胞的可塑性改变,一方面可为神经细胞迁移提供脚手架,促进神经细胞间突触网路的建立,还可释放出兴奋性氨基酸、前列腺素等神经活性物质调控神经细胞的功能〔10,11〕。另一方面,也可促进星形胶质细胞间的信息交流传递,并与神经元相互作用,影响神经元的生物活性,在神经信息传递、整合和调控过程中起关键作用〔12,13〕。由此推断,G-CSF干预后星形胶质细胞的可塑性变化与锥体细胞增生一样,也是认知功能改善的重要病理修复机制。此外,有学者〔14〕提出在脑缺血干预的时机上存在“多个治疗机会窗”的概念,包括脑缺血前初级预防机会窗、次级预防机会窗、脑缺血超早期干预机会窗以及脑缺血损伤后的恢复期和修复期可能存在的“治疗机会窗”。本研究是在大鼠持续性缺血 3个月后给予 G-CSF干预的,结果表明,在错失前期预防、早期干预的情况下,在持续脑缺血时间较长的损伤后期也是重要的补救治疗机会窗。

1 孙 莉,金 涛,丁艳华,等 .慢性前脑缺血致痴呆大鼠脑血流量及行为学对比研究〔J〕.中国老年学杂志,2009;29(8):920-2.

2 王晓明,徐忠信,莽 靖,等 .慢性脑缺血致认知功能障碍大鼠皮层Rho激酶表达变化〔J〕.中国老年学杂志,2009;29(8):944-5.

3 Li Y,Chopp M,Chen J,et al.Intrastriatal transplantation of bone marrow nonhematopoietic cells improves functional recovery after stroke in adult mice〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab,2000;20(9):1311-9.

4 Roitberg B.Transplantation for stroke〔J〕.Neurol Res,2004;26(3):256-64.

5 Gibson CL,Bath PM,Murphy SP.G-CSF reduces infarct volume and improves functional outcome after transient focal cerebral ischemia in mice〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab,2005;25(4):431-9.

6 Yanqing Z,Yu-Min L,Jian Q,et al.Fibronectin and neuroprotective effect of granulocyte colony stimulating factor in focal cerebral ischemia〔J〕.Brain Res,2006;1098(1):161-9.

7 Ni J,Ohta H,Matsumoto K,et al.Progressive cognitive impairment following chronic cerebral hypoperfusion induced by permanent occlusion of bilateral carotid arteries in rats〔J〕.Brain Res,1994;653(1-2):231-6.

8 Barker AJ,Ullian EM.Astrocytes and synaptic plasticity〔J〕.Neuroscientist,2010;16(1):40-50.

9 商永华,王 群,陆兵勋,等 .慢性脑缺血大鼠学习记忆变化及甲状腺激素的影响〔J〕.中国康复医学杂志,2007;22(3):209-11.

10 Tsuda M,Shigemoto-Mogami Y,Koizumi S,et al.P2X4 receptors induced in spinal microglia gate tactile allodynia after nerve injury〔J〕.Nature,2003;424(6950):778-83.

11 Zhang JM,Wang HK,Ye CQ,et al.ATP released by astrocytes mediates glutamatergic activity-dependent heterosynaptic suppression〔J〕.Neuron,2003;40(5):971-82.

12 Shigetomi E,Bowser DN,Sofroniew MV,et al.Two forms of astrocytecalcium excitability have distinct effects on NMDA receptor-mediated slow inward currents in pyramidal neurons〔J〕.J Neurosci,2008;28(26):6659-63.

13 Ge WP,Yang XJ,Zhang Z,et al.Long-term potentiation of neuron-glia synapses mediated by Ca2+-permeable AMPA receptors〔J〕.Science,2006;312(5779):1533-7.

14 Coull BM.The many windows of therapeutic opportunities in stroke〔J〕.Curr Opin Neurol,1996;9(1):43-5.