钙调蛋白信号转导与脑缺血再灌注氧化应激反应的相关性

程 洁 朱 毅 李忠仁 (南京中医药大学第二临床医学院,江苏 南京 210046)

钙调蛋白(Calmodulin,CaM,也称钙调素)是迄今发现的细胞内最重要的钙受体蛋白。Ca2+作为第二信使对细胞功能的调节大多是通过各种钙结合蛋白(CaBP)介导的。现已发现的多种 CaBP,多存在于特定的组织中,从而表现其特殊功能。在各种 CaBP中,研究最多、最重要的是 CaM,它广泛存在于各种组织中。

1 CaM的生物活性和分布〔1〕

CaM是一种能与 Ca2+结合的蛋白质,它由 148个氨基酸残基组成一条长链,其中天门冬氨酸及谷氨酸占 1/4。这种蛋白质分子上有 4个位点可与 Ca2+结合,因此一分子 CaM可与 4个 Ca2+结合(这 4个结合部位由 4个“螺旋-袢-螺旋”结构组成)。当CaM与 Ca2+结合,即成为有活性的钙-CaM复合物(Ca2+-CaM)。CaM作为细胞中一种重要的多功能蛋白,可以激活 40多种酶或者通道,参与许多生物功能,如肌肉收缩、突触传递、神经递质的合成与释放、激素分泌和基因表达等。

CaM存在于脊椎和无脊椎动物、植物、原生动物的所有组织中的几乎所有真核细胞内,在脑内主要分布在海马、纹状体和大脑皮层,大约占脑蛋白的 0.5%。CaM存在于神经元的许多亚细胞成分中,在胞浆液、线粒体、微粒体、突触泡浆和突触膜等部分都有分布,其浓度与脑的正常功能有重要的联系。

2 CaM信号转导、细胞内Ca2+超载与氧自由基的生成

2.1 脑缺血再灌注损伤时Ca2+与CaM的变化 脑缺血再灌注引起脑损伤的发生机制十分复杂,包括兴奋性氨基酸释放增加、细胞内钙超载、自由基生成、一氧化氮(NO)大量释放、细胞酸中毒、凋亡基因激活等。这些环节互为因果,相互影响,形成恶性循环,最终导致细胞不可逆性坏死。有学者提出细胞内钙超载的损害作用是细胞死亡的“最后共同通路”〔2〕。而 CaM作为细胞内钙的主要受体蛋白,在介导Ca2+在脑缺血过程中起着重要的调控作用。

脑缺血再灌注损伤发生后,神经元细胞内Ca2+浓度明显上升,其主要途径有两条:一是细胞外钙离子通过包埋于细胞膜上的钙通道进入细胞质,另一条是细胞内钙储存池(主要为内质网及肌浆网)中钙离子的释放。在细胞质膜上存在两种性质完全不同的钙离子通道,电压依赖性钙通道(voltage-operated Ca2+channels,VOCC)和配体门控钙离子通道(1igand-gated calcium channel,LGCC),而在内质网膜上则存在受体操纵性通道(Store-operator Channel,SOC),这样,钙离子进入胞浆的模式就主要有三种:第一种和第二种是细胞外钙分别通过 VOCC及LGCC进入胞浆;第三种是钙储存池中钙离子通过SOC通道释放入胞浆。VOCC包括 L-,N-,T-,P-,Q-,R-六种,其中以 LVOCC发挥主导作用,LGCC为谷氨酸受体,主要包括两种亚型:N-甲基 D-天冬氨酸(NMDA)受体及 α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-丙酸哇酮(AMPA)受体,其中 NMDA受体对 Ca2+具有高度通透性〔3,4〕。

研究表明〔5,6〕,脑缺血再灌注后,随着神经元细胞内的Ca2+超载,脑组织的CaM活性和含量也明显升高,再灌注后的升高较脑缺血后更为显著。

2.2 CaM对神经元细胞Ca2+超载的调控

2.2.1 CaM介导 VOCC的 Ca2+依赖性失活和易化 VOCC介导的Ca2+超载参与许多细胞内信号传导过程,其中对通道自身活动的调控就是一种重要的形式。这种自调控包括使通道开放减少的失活作用(inactivation)和使通道开放增强的易化作用(faeilitation)〔7〕。这两种类型的自调控对细胞重复活动时的Ca2+流量及其下游活动都有十分重要的影响。许多试验〔8～11〕证明:Ca2+-CaM介导了VOCC的失活和易化。Ca2+-CaM除了对 L型Ca2+通道有调控作用外,对神经元中的 P/Q,N和 T型Ca2+通道也有影响。

2.2.2 CaM调控NMDA受体对 Ca2+超载的影响 有研究表明〔12〕CaM对 NMDA受体有直接作用。CaM抑制剂三氟拉嗪(TFP)可以通过作用于 NMDA受体抑制Ca2+的内流,明显降低谷氨酸导致的神经元损伤,提示 TFP可能通过作用 CaM,进而影响 NMDA受体的开放〔13〕。这对阻止 Ca2+内流对脑缺血再灌注损伤有重要意义。

国内外学者在应用 CaM抑制剂治疗脑缺血的研究中发现〔14～16〕,多种 CaM抑制剂可抑制神经原细胞的 Ca2+内流,从而抑制脑缺血对神经损伤的作用,缩小梗死面积;但具体通过抑制CaM对哪一种或几种途径的Ca2+内流产生抑制尚待进一步研究。

2.3 细胞内 Ca2+超载与自由基的生成 脑缺血时,细胞内Ca2+超载可通过以下途径使自由基产生进一步急剧增多〔17〕。①激活蛋白水解酶,使黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶,同时促进 ATP的降解而生成大量次黄嘌呤,如此时再灌注,在带入大量氧的情况下,黄嘌呤氧化酶作用于次黄嘌呤,便在生成黄嘌呤的同时,产生大量超氧阴离子自由基(O-2);O-2在三价铁离子的催化下与 H2O生成 H2O2,后经 Haber-weiss反应而生成毒性更强的羟自由基(OH-),从而启动了自由基生成连锁反应,通过瀑布反应,可产生更多的自由基如烷自由基、烷氧自由基等。②激活磷脂酶 A2(PLA2)和磷脂酶 C(PLC),使膜磷脂降解,游离脂肪酸特别是花生四烯酸(AA)大量释放。AA在环氧化酶、脂氧化酶作用下进一步形成白三烯,此代谢过程伴自由基产生。③脑缺血时脑细胞线粒体内Ca2+增多,三羧酸循环发生障碍,不能为电子传递链的细胞色素氧化酶提供足够的电子,O2发生自还原生成O-2并漏出线粒体,成为自由基损伤的重要来源。

3 CaM信号转导与 NO的合成

3.1 NO合酶(NOS)与NO的合成 NO是一种自由基性质的气体,其结构简单又极不稳定,具脂溶性,能自由地通过细胞膜,并呈高化学反应性。在体内,NO是在 NOS催化下由 L-精氨酸氧化产生。生成的 NO可被氧自由基、血红蛋白等迅速灭活。有氧条件下,亚硝酸盐(NO-2)、硝酸盐(NO-3)是NO主要而稳定的代谢产物。目前已知,NOS可分为神经元型(nNOS),内皮型(eNOS)和诱导型(iNOS)三种,nNOS和 eNOS又合称结构性 NOS(cNOS)。其中 nNOS生成的 NO通过抑制含Fe2+离子的酶活性,促进超氧亚硝酸阴离子(ONOO-)等超氧阴离子的生成,介导谷氨酸相关的神经毒性作用等机制在脑缺血中起有害作用。另外,NO分子可以与超氧阴离子()反应,生成毒性更大的 ONOO-,并降解为 OH-、自由基〔18〕。

3.2 CaM在 NO合成中的作用 cNOS是一个双区结构,C-端为还原酶区,N-端为氧化酶区。还原酶区含有 NADPH、FAD、FMN和 CaM结合位点,氧化酶区含有血红素(heme)、四氢叶酸(BH4)和 L-精氨酸的结合位点〔19〕。CaM为结构性 NOS(cNOS,包括 nNOS和 eNOS)生成 NO所必需。

当 Ca2+进入细胞内形成 Ca2+-CaM,与 cNOS结合可导致酶的激活。CaM作为一个分子开关,允许电子流从 NOS经基端还原酶区域流向氨基端含血红素区域。当 CaM未结合时,还原酶区域不能供应电子给血红素;结合后,有关电子传递体排列在一起,电子流穿过 NOS活性部位,从而开启 NO合成〔20〕。由于 NOS合成 NO需要 CaM的参与,因此,抑制 CaM的活性会影响 NO的合成。CaM抑制剂对缺氧时 NO的合成产生影响。

4 结束语

CaM信号转导在脑缺血再灌注的氧化应激发生中起重要作用主要体现在:①通过对细胞内 Ca2+超载的调控作用,直接影响了氧自由基生成连锁瀑布反应。②参与了 NOS合成NO的过程。因此,在理论上抑制CaM的活性会减少自由基和NO的生成。而缺血后脑组织损害的实质是自由基引起神经细胞生物膜及亚细胞器过氧化,造成结构及功能的破坏,最终导致细胞死亡。多种 CaM抑制剂可抑制神经原细胞的 Ca2+内流,从而抑制脑缺血对神经损伤的作用,缩小梗死面积。实验结果是否与通过抑制 CaM信号转导在脑缺血再灌注中的氧化应激有相关性,尚缺乏报道,有待进一步探索。已有研究表明〔21,22〕电针能调节脑缺血大鼠脑组织CaM及 Ca2+浓度。以往的研究表明〔23,24〕电针可间接或直接预防及逆转脑缺血再灌流所造成的脂质过氧化及自由基连锁反应,并具有良好的抗氧应激和脑的保护作用。但是,针刺对脑缺血再灌流大鼠的抗氧应激作用是否与其对 CaM信号转导的良性调控有关还不明确。针刺后CaM浓度的变化是否会影响NO的生成;与一些抗氧化剂,如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)等的关系如何;以及其对总体抗氧化能力的影响,也是值得探讨的问题。因此,与 CaM抑制剂相对照,研究针刺对CaM信号转导调控与对脑缺血再灌注抗氧应激作用之间的关系,有利于揭示针灸抗氧应激的蛋白信号转导机制,为各种相关疾病的针灸诊治及预防提供新的思路。

1 董先平,智 刚,徐天乐 .钙调素参与离子通道和受体功能的调控〔J〕.自然科学进展,2002;12(3):232-9.

2 Szabo I,Ioratti M.The giant channel of the inner mitochondrial membrane is inhibited by cyclosporin A〔J〕.JBiol Chem,1991;266(6):3376-9.

3 Soderlnig TR.The Ca2+-CaM dependent protein kinase cascade〔J〕.Ternds Bio chem Sci,1999;24(2):232-6.

4 Rottnigen J,Iversen JG.Ruled by waves?Intracellular and intercellular calcium signalling〔J〕.Acta Physiol Scand,2000;169(3):203-19.

5 李露斯,梁志坚.完全性脑缺血大鼠脑匀浆钙调蛋白、游离脂肪酸及其代谢产物含量的变化〔J〕.中国神经精神疾病杂志,1990;16(1):13-5.

6 徐 仁,孙圣刚,梅元武,等 .线粒体钙、钙调素、兴奋性氨基酸、丙二醛在脑缺血再灌注中变化的实验观察〔J〕.脑与神经疾病杂志,1999;7(5):261-3.

7 Ehlers MD,Augustine GJ.Calmodulin at the channel gate〔J〕.Nature,1999;399(6732):105,107-8.

8 Zühlke RD,Pitt GS,Deisseroth K,et al.Calmodulin supportsboth inactivation and failitation of L-type calcium channels〔J〕.Nature,1999;399(6732):159-62.

9 Tsien RW,Ellinor PT,Home WA,et al.Molecular diversity of voltage-dependent Ca2+channels〔J〕.Trends Pharmacol Sci,1991;12(9):349.

10 Lee A,Wang ST,Gallagher D,et al.Ca2+/calmodulin binds to and modulate P/Q-type caleium channels〔J〕.Narure,1999;399(6732):155.

11 Dunlap K,Luebke JI,Turner TJ.Exocytotic Ca2+channelsin mammalian central neurons〔J〕.Trends Neurosci,1995;18(2):89-98.

12 Saimi Y,Kung C.Calmodulin as an ion channel subunit〔J〕.Annu Rev Physiol,2002;64:289-311.

13 张 目.钙调蛋白抑制剂三氟拉嗪抗脑缺血作用与机制研究〔D〕.浙江大学博士学位论文,2003:69.

14 Sun X,Shin C,Windebank AJ.Calmodulin in ischemic neurotoxicity of rat hippocampus in vitro〔J〕.Neuroreport,1997;8(2):415-8.

15 Stelmashuk EV,Andreeva NA,Manukllova L,et al.Bifonazole modulatesdeath of cultured cerebellar granular cells induced by glutamate and oxygen-glucose deprivation〔J〕.Bull ExPBiol Med,2001;132(5):1076-8.

16 Kuroda S,Nakai A,Kristian T,et al.The calmodulin antagonist trifluoperazine in transient focal brain ischemia in rats.Anti-ischemic effect and therapeutic window〔J〕.Stroke,1997;28(12):2539-44.

17 韩仲岩.自由基与钙超载〔J〕.山东医药,1994;34(2):38-9.

18 Lipton SA,Choi YB,Pan ZH,et al.A redox-based mechanism for the neuroprotective and neurodestructive of effects nitric oxide and related nitroso-compounds〔J〕.Nature,1993;364(6438):626-32.

19 钟慈声,孙安阳.一氧化氮的生物医学〔M〕.上海:上海医科大学出版社,1997:32.

20 Masuoka A,Stuehr DJ,Olson JS.L-arginine and calmodulin regulation of the heme iron reactivity in neuronal nitric oxide synthase〔J〕.J Biol Chem,1994;269(32):20335-9.

21 金智秀,郝晋东,卢 峻,等 .不同时间窗电针对急性局灶性脑缺血模型大鼠脑组织活性钙调素含量影响的研究〔J〕.针刺研究,2003;28(3):178-81.

22 姚 凯,郭 义,胡利民,等 .针刺对大鼠脑缺血超早期脑细胞内外游离钙离子浓度的影响〔J〕.中国中西医结合急救杂志,2005;12(5):303-5.

23 李忠仁,崔 龙,郭志力,等 .电针对脑缺血再灌流脑组织损伤的抗氧应激研究〔J〕.针刺研究,2005;30(2):67-71.

24 穆艳云,李忠仁,牛文民,等 .电针对局灶性脑缺血再灌注大鼠纹状体线粒体 ATP酶与总体抗氧化能力的影响〔J〕.上海针灸杂志,2007;26(1):42-4.