RNA干扰在缺血损伤中的研究现状

刘 敏 杨 俊 李 莉 李书国

(三峡大学第一临床医学院 宜昌市中心人民医院心内科,湖北 宜昌 443003)

RNA干扰(RNAi)是一种转录、转录后、翻译不同水平的基因沉默机制,其可能通过诱导靶基因的染色质结构改变,使靶基因的转录受阻或者抑制靶 mRNA的翻译,令靶蛋白表达受阻,从而达到高效特异地阻断基因表达的目的。自从 1998年Fire〔1〕等发现 RNAi现象以来,RNAi研究取得了突破性进展,被《科学》杂志评为 2001年的十大科学进展之一,并名列 2002年十大科学进展之首。目前 RNAi技术广泛应用于医学研究领域,本文就该技术在缺血损伤中的运用做简要概述。

1 RNAi的发现

1990年美国和荷兰的植物学家为了得到比紫色更深的矮牵牛花,遂将产生紫色素的基因转入其中,却让大多数花朵变成了杂色甚至白色,当时认为这是一种奇怪的“协同抑制”现象。 1995年,康奈尔大学的 Guo等〔2〕在研究线虫 Par21基因时发现反义 RNA和正义 RNA都阻断了基因的表达。1998年华盛顿卡耐基研究所的 Fire研究证明,双链 RNA(double-stranded RNA,dsRNA)在线虫体内可以产生有效的基因沉默现象,并首次将这种现象称为 RNAi。2001年,Elbashir等〔3〕第一次在哺乳动物细胞内证实了合成的小干扰 RNA(small interfering RNA,siRNA)可以产生 RNAi。 2002年 Brummelkamp等〔4〕发现了短发夹 RNA(small hairpin RNA,shRNAs),它可以在细胞内产生内源性的 siRNA,从而提供稳定的的基因沉默。

2 RNAi的机制

细胞内较长的 dsRNA分子被 dsRNA特异性内切酶 Dicer(RNaseⅢ)酶切为长度 19～24 nt大小不等的双链 siRNA,在ATP协助下siRNA的一条链与沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC)结合,通过完全配对的方式识别特异性的mRNA,并特异性切割与之互补的靶mRNA,从而阻断相应基因的表达。同时靶基因的降解产物作为新生的 siRNA继续结合RISC,由此沉默效应被循环放大〔5〕。此外,siRNA还可以在RNA依赖RNA聚合酶的作用下大量扩增,即以siRNA为引物、以靶mRNA为模板延伸生成 dsRNA,经 Dicer酶切割、降解生成大量的次级 siRNA,而次级siRNA又可进入合成切割的循环过程,并进一步放大 siRNA的作用,使RNAi扩散到整个机体并可以传代〔6〕。

3 RNAi与缺血损伤

3.1 RNAi在心脏缺血损伤中的应用 在缺氧条件下,缺氧诱导因子-1α(hypoxiainducible factor-1alpha,HIF-1α)转录水平的上调可以激活几种下游的血管生长因子。然而,HIF-1α能够被脯氨酰羟化酶 2(prolyl hydroxylase enzyme-2,PHD-2)蛋白降解。 2008年 Huang等〔7〕通过 shRNA抑制PHD-2可以显著提高抑制 HIF-1α水平,从而显著提高心肌梗死后小鼠心功能,并改善心肌梗死区域毛细血管及小静脉的生成率。宋慧文等人〔8〕建立了大鼠心肌缺血/再灌注的体外模型,并用蛋白酪氨酸磷酸酶-1B(protein tyrosine phosphastase-1B,PTP-1B)-RNAi处理心肌细胞,结果发现可显著减少与 FasR结合的PTP-1B的数量,增加了蛋白激酶 B(Akt)的磷酸化水平、并激活 Akt,同时减少了大鼠心肌细胞的凋亡,有效地抑制心肌细胞的损伤。近年来 Lisovyy等〔9〕在研究心肌缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,I/RI)机制时,发现花生四烯酸5-脂氧合酶(arachidonate 5-lipoxygenase,ALOX 5)的增加在心肌梗死的病理生理过程中发挥了重要的致病作用,进一步运用 RNAi技术沉默ALOX5,发现可以减少大鼠心肌细胞凋亡、保护受损心肌。

3.2 RNAi在肾脏缺血损伤中的应用 补体系统在调解人肾I/RI有着重要的作用。Zheng等〔10〕试验证明 siRNA沉默补体活化路径的核心组成部分C3,可以减轻肾I/RI,从而降低补体介导的肾损伤和小鼠死亡率。Zheng等〔11〕通过夹紧肾静脉和动脉 25min诱导肾 I/RI损伤,观察 I/RI损伤 2～48 h,发现 C3和 caspase 3基因显著上调。将 C3和 caspase 3 siRNA注入小鼠体内可以有效抑制小鼠 C3和 caspase3基因的表达,显著降低小鼠死亡率及缺血损伤面积。血清糖皮质激素调节激酶 1(serum and glucocorticoid-regulated kinase 1,SGK1)的下调可以促进促红细胞生成素(EPO)的抗凋亡作用。最近,Rusai等〔12〕在建立大鼠单侧肾 I/RI体内模型中,运用 RNAi技术沉默SGK 1,发现可以对 I/RI的肾脏有保护作用。

3.3 RNAi在脑缺血损伤中的应用 Fas基因表达在细胞凋亡中起重要作用。包晓群等〔13〕通过建立体外神经细胞缺血再灌注模型,用 RNAi技术对 Fas基因表达进行抑制,发现 Fas siRNA组较对照组细胞凋亡指数显著下降。Bax是B细胞淋巴瘤家族基因-2(Bcl-2)的异源二聚体,有促进细胞凋亡的作用。叶西就等〔14〕通过 Bax-siRNA抑制了大鼠 Bax mRNA的表达,结果发现抑制了细胞凋亡,减轻了脑缺血再灌注损伤。而 Zheng等〔15〕则在研究大鼠大脑中动脉闭塞模型时发现,运用 RNA干扰技术沉默 Beclin 1基因的表达,可以减少缺血再灌注导致的脑梗死面积及细胞凋亡。

3.4 RNAi在肝缺血损伤中的应用 刘璐等〔16〕发现,对小鼠注射 Fas分子的siRNA后,可以抑制肝脏缺血再灌注后肝细胞Fas分子的表达,从而阻断由 Fas介导的肝细胞的凋亡,达到对肝脏细胞的保护作用。白细胞介素-1受体相关激酶-4(Inteleukin 1 receptorassociated kinase-4,IRAK-4)是造成再灌注期移植肝脏内 kupffer细胞(kupffer cells,KCs)过度激活信号通路的最关键调节因子,而KCs细胞的激活又是诱发 I/RI重要原因之一。因此,刘作金等〔17〕以 IRAK-4为靶点阻断其胞内信号转导,发现shRNAs转染途径能有效减轻大鼠肝移植时 I/RI。同样是研究肝移植 I/RI过程,Schneider等〔18〕发现,运用 RNA干扰技术沉默脯氨酰羟化酶1(prolyl hydroxylaseenzyme 1,PHD1)可以保护肝组织,减少小鼠肝组织 I/RI。

4 小结

RNAi是科学研究的大热点,近几年来该技术在抗病毒、抗肿瘤及临床相关疾病(如哮喘、湿性老年斑病变、慢性阻塞性肺疾病等)的治疗领域中已经取得了较大进展,但是该技术目前在缺血损伤方面的应用还停留在动物实验阶段,相信随着研究的不断深入,RNAi启动的特异基因序列沉默将为人类各脏器缺血损伤治疗提供基因治疗的新方法。

1 Fire A,Xu S,Montgomery MK,et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans〔J〕.Nature,1998;391(6669):806-11.

2 Guo S,Kemphues KJ.Par-1,a generequired for establishing polarity in C elegans embyos,encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed〔J〕.Cell,1995;81(4):611-20.

3 Elbashir SM,Harborth J,Lendeckel W,et al.Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells〔J〕.Nature,2001;411(6836):494-8.

4 Brummelkamp TR,Bernards R,Agami R.A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells〔J〕.Science,2002;296(5567):550-3.

5 Gilmore IR,Fox SP,Hollina AJ,et al.Delivery strategies for siRNA-mediated gene silencing〔J〕.Curr Drug Deliv,2006;3(2):147-51.

6 Hannon GJ.RNA interference〔J〕.Nature,2002;418(6894):244-51.

7 Huang M,Chan DA,Jia F,et al.Short hairpin RNA interference therapy for ischemic heart disease〔J〕.Circulation,2008;118:226-33.

8 宋慧文.PTP-1B小干扰 RNA对缺氧/复氧诱发的大鼠心肌细胞凋亡的影响〔J〕.华中科技大学学报(医学版),2008;37(6):753-6.

9 Lisovyy OO,Dosenko VE,Nagibin VS,et al.Cardioprotective effect of 5-lipoxygenase gene(ALOX5)silencing in ischemia-reperfusion〔J〕.Acta Biochim Pol,2009;56(4):687-94.

10 Zheng X,Feng B,Chen G.Preventing renal ischemia-reperfusion injury using small interfering RNA by targeting complement 3 gene〔J〕.Am J Transplant,2006;6(9):2099-108.

11 Zheng X,Zhang X,Sun H,et al.Protection of renal ischemia injury using combination gene silencing of complement 3 and caspase 3 genes〔J〕.Transplantation,2006;82(12):1781-6.

12 Rusai K,Prokai A,Szebeni B,et al.Role of serum and glucocorticoidregulated kinase-1 in theprotective effects of erythropoietin during renal ischemia/reperfusion injury〔J〕.Biochemical Pharmacology,2010;79(8):1173-81.

13 包晓群,宋冬晶,陈加俊,等 .针对 Fas RNA抑制对缺血再灌注神经细胞的保护作用〔J〕.中国老年学杂志,2006;26(11):1524-5.

14 叶西就 .BoiRNA预先给药对大鼠脑缺血再灌注损伤的作用〔J〕.中华麻醉学杂志,2006;26(9):853-5.

15 Zheng YQ,Liu JX,Li XZ,et al.RNA interference-mediated downregulation of Beclin1 attenuates cerebral ischemic injury in rats〔J〕.Acta Pharmacol Sin,2009;30(7):919-27.

16 刘 璐,王 掉,赖东明,等 .RNA干扰技术对小鼠肝脏缺血再灌注中肝细胞损伤的保护作用及其机制〔J〕.中华实验外科杂志,2004;21(11):1398.

17 刘作金,李生伟,李旭宏,等 .阻断内毒素胞内信号转导通路对大鼠移植肝脏再灌注损伤的影响〔J〕.四川大学学报(医学版),2006;37(5):679-82.

18 Schneider M,Van Geyte K,Fraisl P,et al.Loss or silencing of the PHD1 prolyl hydroxylase protects livers of mice against ischemia/reperfusion injury〔J〕.Gastroenterology,2010;138(3):1143-54.