增生性玻璃体视网膜病变动物模型的改进和评价

赵红梅，盛敏杰，于 靖

（同济大学附属第十人民医院眼科，上海 200072）

增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy，PVR）是导致视网膜脱离手术失败的主要原因之一。眼外伤或者视网膜破裂后，RPE细胞、müller细胞等从原位迁移至玻璃体腔发生增殖和收缩。在此过程中，细胞因子大量产生，胶原和纤维样物质大量堆积，形成视网膜前膜或视网膜下膜，从而引起牵引性视网膜脱离，严重影响视力［1］。根据其病理过程，人们建立各种不同类型的PVR模型，以更好的研究该病的发病机制和防治。

1 模型中常用的动物

1.1 兔子

兔子因为性情温顺、眼球大，晶状体相对小、玻璃体腔体积相对较大，便于进行眼科手术操作和观察等优点而成为PVR模型中最常用的实验动物。最常用的品种是新西兰白兔、青紫蓝兔、中国本种兔等。但是缺点是：兔子和人类的眼底构造稍有不同，兔子没有黄斑中心凹，存在髓线。总体而言，PVR比较容易发生。

1.2 鼠类

大鼠和小鼠也可用于PVR模型，鼠类具有繁殖能力强、饲养管理方便，易于控制、遗传基因组和组织解剖结构和人相似性高等优点。目前在PVR小鼠模型中应用最多的是C57BL/6J小鼠，常用于PVR大鼠模型中的封闭群有：Wistar、Spraque-Dawley大鼠、Brown-Norway大鼠，近交系有Lewis大鼠。大鼠和小鼠应用于此模型的缺点是：眼球体积小，晶状体接近于球形，玻璃体腔体积相对较小，不易于玻璃体腔注射等操作，而且观察不方便。

1.3 其他动物

小型猪、猫以及灵长类动物等也可用于PVR动物模型的建立，但是由于伦理、价格等原因而应用较少。

2 PVR动物模型的建立方法

为了研究PVR的病理发展过程和治疗，现在已不止有25种模型的建立方法［2］。

2.1 玻璃体腔注入细胞

由于玻璃体腔注射后会发生高眼压等并发症，大多数学者在玻璃体腔注射之前会先行玻璃体切割，可以用气体压迫、手术机械性切割［3］等方式，也可以先注射透明质酸酶待玻璃体液化［4］，以利于细胞在玻璃体腔的移行，促进PVR的发生。PVR以及牵引性视网膜脱离的程度与注入的细胞数量呈剂量-效应关系，根据这一关系，可选择出注入细胞的合适数量，制成相应的模型。

2.1.1 RPE细胞：这是PVR动物模型造模方法中最常用的方法之一。这种方法可以模拟RPE细胞在玻璃体内的增殖、移行和分化等过程，而且RPE细胞能分泌多种细胞因子，促进胶原和纤维的形成，形成明显的视网膜前膜，很好的突出了疾病的本质，并且可以进行定性、定量研究，可重复性强。可以用自体同源、同种异体或者异种的RPE细胞。为了提高造模成功率也可以联合富含血小板血浆或者müller细胞。

2.1.2 成纤维细胞：将成纤维细胞注入玻璃体切割后的眼内，也可制作成典型的PVR模型。成纤维细胞注入眼内后，就会以残余的玻璃体胶原和透明质酸为支架生长繁殖，形成模样物，牵拉下方的视网膜，造成后部PVR。成纤维细胞容易获取，培养时生长良好。细胞可以取自自体或异体的皮肤［5］、结膜［6］等组织。异体和自体成纤维细胞的结果在时间和程度方面无差异。并且此模型容易重复，这种造模方法也备受青睐。

2.1.3 巨噬细胞：巨噬细胞是一种终末细胞，不能转化和增生，但它们能分泌多种细胞因子。将巨噬细胞注射到玻璃体腔也能形成PVR动物模型［7］。在此模型中，眼内的增生细胞如RPE细胞等均来自宿主自身，这种模型以炎症启动阶段为起点，可用于观察早期的炎性细胞因子的含量变化及对细胞增生的调控作用。而且巨噬细胞的采集和纯化相对简单。

2.1.4 神经胶质细胞：将神经胶质细胞注入大鼠玻璃体腔也可以建立PVR模型。Francine等［8］在大鼠玻璃体腔单一注射RPE细胞、müller细胞以及联合注射，发现在大鼠PVR模型中，müller细胞诱导PVR的能力大于RPE细胞，而且联合注射明显优于单一细胞注射。

2.1.5 其他类型细胞：内皮细胞、软骨细胞、胚胎细胞等也可以用于PVR建模［9］。但是由于此过程与PVR自然发病过程相距甚远，实际应用较少。

2.2 玻璃体腔注射富含血小板血浆或富含血小板血浆联合细胞

富含血小板血浆（platelet-rich-plasma，PRP）中富含大量的血小板，血小板可以分泌多种细胞因子，比如PDGF、TGF等，这些因子可以促进细胞的增殖、纤维的形成，促进纤维向视网膜粘附，形成PVR模型。

PRP联合细胞注入玻璃体腔时，PRP中细胞因子的释放对注入细胞有促增生、促粘附的作用，能更好的建立PVR模型。Zheng等［10］尝试了在大鼠玻璃体腔单纯注射RPE-J细胞、玻璃体腔单纯注射PRP、玻璃体腔联合注射RPE-J细胞和PRP三种方法来建立大鼠PVR模型，最后发现玻璃体腔联合注射的建模成功率明显高于单独注射。

2.3 较大巩膜切口制成的PVR模型

有巩膜切口存在时，眼部的细胞如RPE细胞等直接暴露于玻璃体环境中，由于微环境的改变，RPE细胞发生迁移和增生，转化成成纤维细胞，有收缩胶原和纤维的活性。与人孔源性视网膜脱离引起的PVR发生过程相似，联合玻璃体腔注射细胞或者富含血小板血浆等操作能成功的建立PVR动物模型，但是外伤性PVR模型是人为的造成网脱，并不是由于玻璃体牵引引起的裂孔，而且手术操作复杂，影响因素较多，难以定量，病变程度的一致性和模型的可重复性较差。

由较大巩膜穿孔伤以及眼后段穿孔伤制成的PVR模型与人外伤所致的PVR的发生相似，但这一模型由于血液存留在玻璃体内，使早期眼底窥不清，不利于早期观察。

2.4 dispase酶消化法

dispase是细胞实验时常用的一种分解组织的酶，可以选择性的降解四型胶原和纤维连接蛋白，降解细胞外基质，为细胞的移行和分化创造条件。注射时，或多或少都有出血的发生，血液中的淋巴细胞、血小板等都参与了PVR的发生。Elizabeth等［11］首次报道了可以用dispase建立PVR模型，而且玻璃体腔或者视网膜下腔注射dispase，都可以成功建立PVR的兔模型，最佳剂量是0.05U～0.07U。dispase用量小，价格便宜，且建模操作简单，对动物的创伤小，而且不需要引入外源的细胞成分，与临床PVR更接近。但是这种造模方法有较多的副作用［12］，比如晶体脱位、白内障等。因为内界膜成分和基底膜非常相似，dispase分解基底膜的同时也破坏了内界膜的本身结构，使müller细胞足板暴露［13］，在使用dispase建立PVR模型时要考虑到这些副作用。

2.5 玻璃体腔注射细胞因子

细胞因子如IL-1β、PDGF等可以促进RPE细胞等的增殖、迁移、分化等活性，将其注射到玻璃体腔也可以造成PVR模型。Gregory等［14］在外力造成视网膜裂孔后，将IL-1β注入玻璃体腔，也可以造成兔PVR模型，但是这种造模方法由于引入了外源性的细胞因子，与临床所见的PVR的发生发展过程较大差异，因此限制了这种方法的使用。

2.6 其他方法

Shizuya等将小鼠的晶体摘除，直接外力损伤RPE细胞层，也可以造成小鼠前部PVR模型［15］，但是模型与临床PVR相差甚远，应用有限；此外在巩膜伤后向玻璃体腔注入全血［16］或者血小板［17］也能诱导PVR的发生，但是所需时间比较长，增生程度轻；也有学者用眼内异物造模，但是铁等异物的存在会造成视网膜明显的毒性作用；也可用转基因［18］］的方法来诱导细胞因子的表达从而形成PVR，但此法对实验操作技术的要求较高。

3 PVR模型评价方法和分级

3.1 模型的评价方法

PVR建模后一周内每天用直接眼底镜或间接眼底镜观察眼底，之后每周观察一次眼底，观察周期一般是28d以上，眼底镜检查主观性较强。也可以用眼科B超来辅助诊断有无PVR的发生，适用于兔子等眼球较大的动物，但是鼠类眼球小，一般的B超探头难以分辨模型建立与否。也可以选择用光学相干断层扫描（optical coherence tomography，OCT）或者视网膜电图（electroretinogram，ERG）来评价模型，此外，螺旋CT可以对兔眼PVR模型中增殖膜的密度等进行定性和定量分析［19］。在诸多方法中，最客观的评价方法是组织病理切片，可以从组织学角度客观的评价模型建立与否。

3.2 模型的分级

在兔PVR模型的分级中，应用最多的是Fasternburg分级标准［20］。该标准共有五个等级：I级眼底正常，玻璃体内可见增殖条带；Ⅱ级局灶性牵拉，局限性血管改变，充血扩张等；Ⅲ级髓线处的局限性网脱以及视网膜皱褶；Ⅳ级广泛的视网膜脱离，全部髓线脱离，视盘周围视网膜脱离；Ⅴ级视网膜全脱离、对折以及裂孔形成。

Weiss等［21］将兔PVR模型按照病变程度分为六级：0级无增生；0.5级玻璃体勉强可见增生痕迹；1级有细小增生束，但无真正的条索形成；2级有浓厚的增生束形成；3级有细薄的增生条索；4级有浓厚的增生条索。

我国的梁厚成等［22］也制定了兔PVR模型的分级标准：0级：眼底正常未见增生；I级：玻璃体内有少量纤细的增生条带；Ⅱ级：玻璃体内有较多粗大的增生条带；Ⅲ级：玻璃体内有膜状增生条带；Ⅳ级：增生条带牵拉髓线抬高，或有局部视网膜脱离。

Francine等［8］制定了Lewis大鼠PVR的分级标准：0级无增殖反应；1级玻璃体内增殖；2级视网膜前膜以及视网膜皱褶形成；3级视网膜前有致密白膜形成，视网膜皱褶、局限性网脱，伴有或不伴有局限性后囊膜型白内障。

Zheng［10］制定了Wistar大鼠PVR模型的分级标准：0级无增殖反应；1级玻璃体雾状浑浊，增殖条带形成；2级单个或者多个象限的视网膜皱褶；3级单个象限的视网膜前膜形成；4级两个或两个以上象限的视网膜前膜形成。

4 问题与展望

目前PVR模型的所用动物还是以兔子为多，且造模方法复杂，不同的造模方法建立的模型有差异。就实验效果而言，联合注射不同的细胞或者细胞和PRP联合注射成膜率更高，就实验操作而言，兔子玻璃体腔较大，易于观察，而且单纯玻璃体腔注射操作相对容易。实验者要分析各种方法的利弊，从实验目的着手选择合适的实验动物和实验方法来建立PVR动物模型。相信以后会有简单易行而又稳定的造模方法出现，以便更好的研究该疾病。

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