Fmr1基因敲除对小鼠生理发育和繁殖性能的影响

戴丽军，叶炳飞，黄月玲

（广州医学院实验动物中心，广州 510182）

人类脆性X综合征（fragile X chromosome syndrome，FraX）是最常见的遗传性智力低下疾病之一，目前发现X染色体上Fmr1基因的缺陷是该病的诱因。Fmr1基因的表达产物是FMR1蛋白（FMRP），FMRP在生物体中枢神经系统和生殖系统的发育过程中起着重要作用［1］。Fmr1基因敲除小鼠（FVB.KO）是以正常近交系FVB小鼠为背景，利用基因敲除技术将Fmr1基因定点灭活制备而成的动物模型［2］，目前已广泛应用于FraX的研究。

我们利用毒理学和畸胎学相结合的行为致畸试验方法［3］，对广州医学院实验动物中心饲养的清洁级FVB.KO和FVB进行了一系列生长发育和神经行为功能的测试，并对所获得的数据加以分析比较，借以了解Fmr1基因敲除对动物的繁殖性能和生理发育、尤其是子代神经系统功能发育的影响，为该基因敲除品系小鼠的研究应用提供背景资料。

1 材料和方法

1.1 实验动物

FVB.KO和FVB于2002年由广州医学院神经科学研究所从荷兰Erasmus大学实验动物科学中心引进，经广州医学院实验动物中心繁育饲养，分别建立了清洁级种群。（合格证号：2004A053和2004A052）。

选取10周龄清洁级FVB.KO和FVB种鼠各20只，雌雄各半进行实验。

1.2 实验环境

实验小鼠均饲养在清洁级环境中，合格证号：饲养环境2004B022；实验环境2004C075。室内温度为20℃～26℃，相对湿度为50％～70％，光照明暗交替12h：12h。

1.3 实验仪器

JJ100电子天平，精确到0.01g。常熟双杰测试仪器厂制造。

1.4 测定方法

选用10对FVB和10对经PCR检测为FVB.KO的10周龄种鼠，采取1∶1全部同胞兄妹近亲繁殖的方法，连续生产。动物饮用酸化水（pH2.5～3.0），食用全价营养饲料，饮水和饲料每日更换一次，垫料每周更换两次，所用物品均通过高温高压灭菌（121℃，30min），饲养流程严格按照清洁级实验动物设施SOP操作。

选取各对第2胎仔鼠进行繁殖性能和生理发育的观察记录。

繁殖性能测定指标包括：窝产仔数、初生仔鼠体重、初生仔鼠体长、离乳均重、离乳体长、雌雄比例和离乳率［4］。

生理发育测定指标包括：耳廓分离、体毛长出、门齿萌发和眼睑开裂［5］。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 Fmr1基因敲除小鼠的繁育

FVB.KO小鼠为近交系小鼠，按照要求，选择遗传特征稳定、繁殖能力强、母性好的FVB.KO全部同胞兄妹，按雌雄1∶1的方式进行繁殖。图1～4显示的是FVB.KO小鼠的正常繁育状态。

图1 雌雄1∶1同胞兄妹繁殖（雌鼠已孕）Fig.1 Brother-sister breeding（the male mouse was pregnant）

图2 带乳鼠Fig.2 Lactation mouse and suckling mice

图3 雌雄种鼠及新生鼠Fig.3 Father，mother and newborns

图4 雌雄种鼠及幼鼠Fig.4 Father，mother and their babies

2.2 Fmr1基因对小鼠繁殖性能的影响

经t-检验，与FVB比较，FVB.KO的窝产仔数、离乳率等值偏低，但无显著差异（P＞0.05）。两品系的雌雄比例有极显著差异（P＜0.01）（表1）。

表1 FVB.KO与FVB的繁殖性能Tab.1 The reproduction performance in FVB.KO and FVB

2.3 Fmr1基因对小鼠生理发育指标的影响

经t-检验，两品系在耳廓分离、体毛长出、门齿萌发和眼睑开裂的时间方面差异不显著（表2）。

表2 FVB.KO和FVB生理发育指标测定Tab.2 The indices of behavioral development in FVB.KO and FVB

3 讨论

实验动物品系在长期封闭繁育的过程中，基因得以明确并稳定遗传，形成了各自遗传特性（包括繁殖性能）方面的明显差异［6］。Fmr1基因敲除小鼠（FVB.KO）是以正常的近交系FVB小鼠为背景，利用基因敲除技术，敲除X染色体上的脆性X智力低下1号基因（fragile X retardation-1，FMR1）制备的人类脆性X综合征（fragile X syndrome，FraX）动物模型。Fmr1基因在生物体发育过程中持续表达，具有组织特异性和时间特异性，该基因参与中枢神经系统和生殖系统发育过程的调节。脆性X综合征是一种发病率仅次于先天愚型的遗传性先天性智力低下综合征，是由Fmr1基因缺陷引起Fmr1蛋白（fragile X retardation-1 protein，FMRP）合成减少而导致的，是X连锁不完全显性遗传病。该病在人群中发病率男性约1/4000，女性约1/8000。患者的体征、认知及行为特征取决于性别和分子突变情况［7-9］。

神经行为毒理学方法通常用于筛检具有神经毒性的化学物和药物，主要分为两类：生理发育和行为分析。1991年，美国EPA提出行为测试指南包括行为功能观察、活动度、程度控制行为测定，后来又增加发育神经毒测定，包括行为功能测定、活动度、听觉惊愕、学习和记忆等［10］。鉴于神经系统的发育是一个精密的时程化改变过程，这一过程中的每一步骤都必需在时间和空间上准确无误地进行，任何一个环节发生障碍都将导致神经功能的改变［3］，我们将这一方法推广至研究与神经系统生长发育相关的基因功能的检测，为神经系统发育的基因作用提供简单有效的评价手段。

在实验中我们选择遗传特征稳定、繁殖能力强、母性好的FVB.KO和FVB进行繁育，对各品系第二胎新生仔鼠的多项生理发育和繁殖性能指标进行了较全面的测定分析［3-6］，初步研究了Fmr1基因敲除对动物繁殖与生理发育的影响。在繁殖性能方面，FVB.KO不仅具有其背景FVB的特点，而且具有基因敲除后形成的自身特点。FVB.KO除窝产仔数、离乳率等指标偏低外，与FVB比较，最大的差异是雌性后代所占的比例明显降低。从实验结果可知，FVB雌性后代数量是其雄性后代数量的1.64倍，而FVB.KO则是0.85倍，两者间差异极显著。造成这种结果的原因尚待进一步分析，我们会在今后的繁育过程中密切跟踪。在生理发育方面，FVB.KO与FVB在耳廓分离、体毛长出、门齿萌发和眼睑开裂的发育时间上较接近，没有明显差异。可初步得出结论：FMR1基因的破坏对小鼠生理发育各项指标的影响不大。

［1］黄涛，沈岩，吴冠芸.FMR1基因结构与功能［J］.生理科学进展，1995，26（3）：218-222.

［2］Cathy E.Bakker，Coleta Verheij，Rob Willemsen，et al.Fmr1 Knockout Mice：A model to study fragile X mental retardation［J］.Cell，1994，78：23-33.

［3］姬艳丽，佘素贞，豆正东，等.昆明种小鼠正常行为发育指标探讨［J］.安徽医科大学学报，2002，37（6）：429-432.

［4］吴清洪，顾为望，张嘉宁，等.SPF级C57BL/6J小鼠生长发育和繁殖性能指标的测定［J］.中国比较医学杂志，2006，16（10）：606-607，614.

［5］Brunner RL，Mclean M，Vorhees CV，et al.A comparison of behavioral and anatomicalmeasures of hydroxyurea induced abnormalities［J］.Teratology，1978，18：379-384.

［6］任连生，白喜花，闫磊，等.SX1近交系小鼠生长繁育主要指标的测定［J］.中国比较医学杂志，2007，17（8）：470-472.

［7］罗莉，邬晋芳，夏露.脆性X综合征FMR1基因研究进展［J］.中国妇幼健康研究，2006，17（5）：415-417.

［8］戴丽军，黄莉，廖军.长爪沙鼠血清雌性激素的比较研究［J］.中国实验动物学报，2005，13（4）：246-248.

［9］黄涛，沈岩，吴冠芸.FMR1基因结构与功能［J］.生理科学进展，1995，26（3）：218-222.

［10］Karlberg J.儿童早期生长迟缓［J］.中华儿童保健杂志，1996，4（3）：11-12.