利用人脐带血干细胞制备人鼠肝组织嵌合体模型

周 笛，范 沛，张 建，顾为望，姚 刚，刘光泽

（1.南方医科大学实验动物中心暨比较医学研究所，广州 501515；2.新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830052；3.解放军第四五八医院全军肝病中心，广州 510602）

人脐血中富含丰富的脐血干细胞，而且来源丰富、简单易得，目前成为干细胞研究的应用热点，脐血干细胞在诱导因子作用下可分化为肝细胞，这个在体外研究早已有报道［1，2］。这无疑给肝病的治疗带来很大的有利条件。据世界卫生组织调查，全球约有20亿人感染过乙型肝炎病毒（HBV），其中3.5亿是慢性HBV携带者。HBV又是肝细胞癌（HCC）的主要诱因，流行病学研究表明，乙肝与肝细胞癌（HCC）的发生密切相关［3，4］，因此HBV深切关系着人们的生命和健康。乙型肝炎的研究长久以来面临缺少稳定可靠的HBV感染细胞模型和动物模型，从而阻碍了对HBV致病机制、抗病毒药物筛选和疫苗研制等的研究进程。近年来随着肝移植技术的迅速发展，小鼠肝脏嵌合人肝细胞将为人类针对人体肝脏疾病和肝细胞病毒的研究提供佳的体内模型［5］。我们以裸鼠作为受体，通过移植人脐血造血干细胞，探索建立一种制备人肝组织嵌合的动物模型可能性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：年龄为6周的雄性裸鼠（BALB/c nu-小鼠）21只（其中5只为对照组），体重18～22g；另选取年龄为6周、体重18～22g的雄性KM小鼠5只，作为对照组，均购自南方医科大学实验动物中心，饲养于中心SPF级动物实验部［SCXK（粤）2006-0015］。

1.1.2 人脐带血干细胞：由广东省脐带血造血干细胞库（广东省妇幼保健院）提供。

1.1.3 HBV阳性血清：由解放军第四五八医院全军肝病中心提供，血清HBVDNA定量检测为107copy/mL。

1.2 方法

1.2.1 人脐血干细胞的移植：取裸鼠17只作实验组，每只经尾静脉注射0.2μL人脐带血干细胞，1周后，再次按同样方法再次移植0.2μL人脐血干细胞。并持续观察。

1.2.2 HBV的感染和检测：移植干细胞后第21天经尾静脉每只注射0.1mL人HBV血清。7d后取肝组织，HBsAg免疫组化检测。

1.2.3 肝脏甲胎蛋白的免疫组化检测：实验组裸鼠经颈椎脱臼处死，取肝脏组织，大小约0.5cm×0.5cm×0.3cm，4％多聚甲醛固定，水洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，脱蜡至水，3％H2O2处理15min，柠檬酸缓冲液微波抗原修复10min，一抗（兔抗AFP多克隆抗体，购自Invitrogen，编号：18-0055）。

1.2.4 血清甲胎蛋白和白蛋白的定量检测：感染1周后取实验组小鼠血清，经摘除眼球取静脉血，每只约取1mL，4℃、3000r/min离心15min分离各约200μL血清，常规放射免疫法测定血清甲胎蛋白和全自动生化仪测定血清白蛋白含量。另用同样方法定量检测正常裸鼠和KM小鼠（各5只）血清作为对照组。

1.2.5 数据分析：利用SPSS13.0（SPSS Inc.U.S.A）分析数据。

2 结果

2.1 人脐血干细胞的移植

实验组裸鼠共成功注射17只，其中2只非正常死亡，剩下15只生存状态良好。

2.2 血清甲胎蛋白和白蛋白含量

不同组别间血清甲胎蛋白和白蛋白含量比较见表1。实验组裸鼠肝组织的AFP含量显著高于裸鼠和KM鼠的对照组（P＜0.05）；而实验组裸鼠肝组织中的ALB含量则低于裸鼠和KM对照组（P＜0.05）。

表1 不同组别间AFP和ALB含量Tab.1 The contents of AFP and ALB in different groups

2.3 肝脏甲胎蛋白的表达

用免疫组织化学方法对移植人脐血干细胞的裸鼠于进行肝脏组织AFP检测，移植后第7天（图1）即可观察到AFP阳性细胞存在，阳性细胞分布于肝表面及肝小叶内，AFP在细胞质内表达。再分别对移植后14d（图2），21d（图3）的小鼠肝脏检测，均可见到AFP阳性肝细胞，表明嵌合的人肝细胞可一定时期在小鼠的肝脏内存在。（图见彩插2）

2.4 乙肝血清病毒感染后肝脏HBsAg组化

乙肝血清病毒感染7d后，取小鼠肝脏组织HBsAg组化检测，显示阳性（图4），显微镜低倍镜下可显示密集成片的阳性细胞。HBsAg在细胞质内表达，呈现棕黄色。表明人脐血干细胞在小鼠体内不仅存活，而且能被乙肝血清病毒感染。（图见彩插2）

3 讨论

干细胞能在正常肝脏内存活可分化成肝细胞［6］。脐血造血干细胞的含量等于或超过骨髓，并且常常高于成人外周血。造血干细胞进入体内后在肝脏内可以转化为肝细胞或胆管细胞［7］。还有研究证明，脐血干细胞在小鼠体内可以自分泌方式提供自身某些生长因子，促进自身增殖分化［8］。BALB/c裸鼠先天性胸腺发育不良，体内T细胞数量明显减少，缺乏细胞免疫功能，并且价格容易获得，以此为实验动物制备小鼠感染HBV的人鼠肝脏嵌合模型具有重要的意义。故本研究采用尾静脉注射移植人脐带血干细胞的方法制备人鼠肝嵌合体小鼠，方法简便，成功率高。

AFP是人体胚胎时期胎儿肝细胞和卵黄囊内合成的一种糖蛋白，胎儿出生1～2周后迅速下降至成人水平（0～20μg/L）［9］。AFP的生成量和胎儿肝脏或肝细胞再生时的分裂细胞数量呈正相关，故有人认为AFP是由分裂增殖的肝细胞所产生，也可用于了解肝细胞再生情况［10］。因此我们以AFP作为检测指标，用免疫组化法来检测嵌合小鼠肝组织。脐血干细胞移植7d后采集小鼠肝脏标本检测到AFP阳性细胞，AFP表达于肝细胞质中，染色细胞细胞质出现棕黄色颗粒。显微镜下观察可见细胞呈圆形，类圆形，为成熟肝细胞表型，与正常肝细胞相似。之后又对第14天、第21天采集的小鼠肝脏标本进行AFP免疫组化检测，阳性表达持续，分析人脐血干细胞在实验组裸鼠的肝脏内分化成为有活性的人肝细胞。对照组肝脏组织中AFP则显示阴性。HBV感染后7d，肝脏组织HBsAg免疫组化检测显示阳性。此外，RIA定量测定实验组和对照组的AFP和ALB的统计结果显示有显著差异（P＜0.05）。实验组的AFP明显高于对照组，实验组裸鼠肝脏组织经免疫组化可看到肝脏组织呈现棕黄色，表明有阳性细胞存在，提示有新的人肝细胞生成。

ALB主要由肝细胞合成分泌［11，12］，其它组织细胞分泌极少，是最常用和最可靠的肝细胞功能检测指标。ALB的检测可代表肝脏的合成和储备功能。肝细胞的成熟会使ALB合成增多，而细胞的活力下降会使ALB合成减少。实验组在感染后的ALB含量低于正常小鼠，提示肝细胞在体内存活并具有生物学特性。已有研究证明肝损伤可使ALB降低［13］，提示实验组被感染肝脏肝功能受损、使蛋白质的合成、细胞内运输和释放发生障碍促使ALB低于对照组。

有人利用人类特有的肝脏细胞、胆管细胞、内皮细胞标记物来分析脐血干细胞移植小鼠肝脏细胞；用FISH试验检测人和鼠的DNA，RT-PCR检测人ALB，结果表明：人血清白蛋白（hALB）、G蛋白（GS）、抗细胞角质蛋白-18（CK-18）、AFP、抗细胞角质蛋白-19（CK-19）、ALBmRNA、CK-18mRNA、AFPmRNA等在鼠肝组织中被发现［14-16］，证明了人类脐血干细胞可以在NOD/SCID小鼠肝内生长，并分化成为成熟肝细胞。另外，利用双免疫荧光染色法（抗人类肝细胞和抗人类ALB抗体）亦可证明嵌合鼠肝脏内存在能产生ALB的脐血来源的实质细胞，表现与正常肝细胞一样的双核结构，并且持续到55周仍可被检测到［16］，更是证明了这一理论的可靠性。所以，本实验将人脐血干细胞移植到裸鼠肝脏内，并用HBV进行感染，制备了HBV人鼠嵌合肝模型。为进一步研究提供了实验基础，同时也为脐血干细胞在肝脏疾病中的应用提供了技术支持。

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