高脂高糖饮食结合链脲佐菌素建立2型糖尿病大鼠模型的改良

蒋朝晖，吕玉晶，赵 芳，朱丽英，杨国珍，潘 卫

（贵阳医学院医学检验系，贵阳 550004）

高脂高糖饮食结合小剂量的STZ是建立2型糖尿病动物模型的常用方法，该造模方法具有方法简单、成本低廉、模型稳定以及与人类2型糖尿病临床特征较为吻合等优点。现有研究报告多选用成年大鼠建模［1，2］，由于建模需时较长，模型大鼠容易进入老年期，生存质量下降没有充分的时间保证糖尿病并发症的发生和发展。本研究在参考前人的研究基础上，利用SD幼鼠建立2型糖尿病及其并发症模型，并摸索了STZ的用量和取血方式等，对建模方法进行了改良。

1 材料和方法

1.1 动物分组及喂养

健康清洁级4周龄SD雄性幼鼠40只，由贵阳医学院动物中心提供［SCXK（黔）2002-0001］。测定每只大鼠的空腹血糖，血糖正常者进入实验，随机分为对照组和实验组，每组20只。每笼为同组的大鼠5只，自由摄食饮水，自然光照。

1.2 试剂与饲料

STZ（美国Sigma公司），胰岛素测定试剂盒（北京北方生物技术研究所），血糖仪、血糖试纸（美国雅培公司），甘油三酯、胆固醇、ALT、AST检测试剂盒（四川迈克公司）等。普通饲料：碳水化合物60％、蛋白质22％、脂肪10％、其他8％。高脂高糖饲料：动物脂肪15％、蔗糖20％、胆固醇5％、普通饲料60％，饲料由贵阳医学院动物中心加工。

1.3 SD幼鼠胰岛素抵抗的诱导

对照组喂以普通饲料，实验组喂以高脂高糖饲料，每15天监测一次体重，4个月后尾动脉取血，检测空腹血糖、空腹胰岛素、甘油三酯和胆固醇，以胰岛素作用指数（Insulin action index，IAI）评价其胰岛素抵抗程度，IAI=ln［1/（空腹胰岛素×空腹血糖）］，IAI＜对照组即为诱导胰岛素抵抗成功［3］。

1.4 STZ致糖尿病亚致病剂量的确定

另外选取成年健康SD雄性大鼠25只，适应环境1周。将25只大鼠随机分为对照组、D20、D30、D40、D50组，禁食12h后，对照组腹腔注射枸橼酸缓冲液，D20、D30、D40、D50组分别按20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg的剂量腹腔注射STZ溶液，72h后尾部取血测定空腹血糖。选择能使血糖升高但低于糖尿病标准（本研究确定为介于4.61mmol/L～7.1mmol/L之间）的剂量为STZ亚致病剂量。

1.5 2型糖尿病大鼠模型的建立

胰岛素抵抗诱导成功后，实验组大鼠空腹腹腔注射亚致病剂量的STZ（以pH4.4，0.01mmol/L枸橼酸缓冲液配成20g/L浓度），对照组仅注射相同体积枸橼酸缓冲液。注射STZ72h后，空腹血糖＞7.0mmol/L、隔天随机血糖＞11.1mmol/L者即为2型糖尿病大鼠模型。每周通过尿试纸检测实验组尿糖，间接观察其血糖的变化趋势。

1.6 2型糖尿病并发症的观察

继续高脂高糖饮食喂养2型糖尿病大鼠使病程发展，逐月分批眼球摘除放血处死大鼠，检测其生化指标并结合脏器的病理变化来评价糖尿病并发症的发展。

1.7 数据处理

2 结果

2.1 高脂高糖饮食对大鼠的影响

与对照组大鼠比较，高脂高糖组大鼠经喂养4个月后，体重明显增加，血糖升高，血清胰岛素水平升高，实验组IAI＜对照组，血脂紊乱（表1），以上指标说明高脂高糖饮食诱导大鼠胰岛素抵抗成功。

表1 4个月时高脂高糖组与对照组大鼠基本特征比较Tab.1 Basic characteristics of rats with high-fat/high-sucrose and healthy controls at 4 months

2.2 STZ致糖尿病亚致病剂量

腹腔注射STZ后，D20、D30、D40、D50各组大鼠空腹血糖均有不同程度的升高（图1），其中30mg/kg大鼠体重的剂量能导致空腹血糖升高（6.27±0.17mmol/L），但低于致糖尿病的标准（7.0mmol/L），确定为STZ亚致病剂量。

2.3 2型糖尿病大鼠成模情况

实验组20只大鼠在高脂高糖喂养过程中，体重增长速度快于对照组，4个月后100％出现胰岛素抵抗，注射30mg/kg剂量的STZ后，实验组20只大鼠血糖明显升高，其均值为13.7±1.57mmol/L，大鼠出现缓慢的消瘦、饮食大幅增多，24h尿量明显增多，部分大鼠出现烂尾现象，具有糖尿病典型的“三多一少”临床表现，说明2型糖尿病大鼠模型建立成功。成模后，其尿糖水平一直保持在“+++ ～++++”，说明模型稳定性较好。

图1 不同剂量STZ组大鼠血糖水平Fig.1 Blood glucose levels in different dose of STZ

2.4 2型糖尿病大鼠部分脏器的病变情况

在2型糖尿病大鼠成模3个月后，大鼠的胰腺、肝脏、肾脏、脾脏和脑组织等多个器官发生病变。现以肝脏为代表进行报道。

与正常对照组比较，2型糖尿病组大鼠肝脏体积增大，出现明显的脂肪肝病变（图2）。HE染色显示肝细胞明显空泡变性（图中箭头所示）、可见点状坏死，汇管区有炎细胞浸润（图3）。（图见彩插1）

3 讨论

胰岛素抵抗与胰岛功能受损是2型糖尿病的发病机理中不可缺少的两个重要因素，并且胰岛素抵抗是2型糖尿病的始动因素［4］，而长期高脂高糖量饮食喂养能诱导大鼠能产生胰岛素抵抗［5］。在此基础上，我们采用高脂高糖饲料喂养SD幼鼠形成胰岛素抵抗，再给予亚致病剂量的的STZ建立2型糖尿病模型，继续高脂高糖喂养，使其血糖维持在高水平，形成2型糖尿病并多种并发症。通过对对照组和实验组大鼠的多个生化指标以及脏器病理变化的观察，表明本研究成功建立了2型糖尿病及其并发症模型。

采取幼鼠造模的优势：由于形成胰岛素抵抗的时间需要4个月，成年大鼠经过4个月的饲养后，有可能进入老龄期，老龄化会导致胰腺功能减退、空腹血糖、胰岛素升高［6］。采用一个月的幼鼠造模，此时实验大鼠年龄为5个月，处于成年期，成年大鼠对于STZ造成胰腺损伤修复功能较强，能保持血糖水平不至于太高，延长了模型大鼠的生存时间，有充分的时间保证2型糖尿病并发症的发生和发展。在建模过程中，经高脂高糖饮食喂养4个月后，大鼠还具有典型的腹部肥胖、血脂紊乱、血压升高等代谢综合征的特点［7］，可用于代谢综合征发病机制和脂毒性等相关研究。同时，流行病学研究发现2型糖尿病及其并发症在肥胖儿童人群中发病率呈上升趋势［8-10］，采用幼鼠造模符合这一特点，能为肥胖儿童糖尿病研究提供实验基础。

STZ亚致病剂量的确定：STZ能特异性杀伤胰岛β细胞是诱发糖尿病的机制，目前对于STZ的用量和用法均有不同的观点。多数研究都是参考他人报道剂量，由于大鼠的个体差异而存在一定的缺陷。本研究通过实验，观察不同剂量STZ对大鼠血糖的影响，确定了本研究的用量，这是对该类建模方法的有益补充。

在建模方法上，本研究还摸索了大鼠取血方式：对于少量的用血（1mL以下），如用血糖仪测血糖时，可用针刺尾静脉或断尾取血；自体前后对照和长期间断取血，用血量大（1mL以上），但又不能危害大鼠生命时，如检测大鼠血脂、肝功能时，可从尾动脉用注射器取血；需大量用血（5～10mL）且不需顾及大鼠生命时，可以摘眼球取血。通过上述方法采取的血液具有无污染、不溶血的特点，能满足不同的实验需要。

2型糖尿病大鼠模型的判断标准有待商榷：目前对于2型糖尿病模型诊断标准目前尚无统一标准［11］，主要是空腹血糖结合胰岛素抵抗来判定。由于造模方法和模型遗传背景的差异，血糖升高标准也各不相同，从7.8mmol/L～16.8mmol/L均有报道［1，2］。由于大鼠采血困难，本研究采用空腹血糖和空腹胰岛素来评价2型糖尿病，血糖水平采用的是ADA90制定的人类2型糖尿病的判断标准，略低于报道水平，实验结果也表明模型大鼠血糖水平为13.8±2.2mmol/L，如何确定一个合理的血糖升高范围有待进一步研究。

总之，本研究在借鉴前人研究的基础上，对建立2型糖尿病及其并发症大鼠模型进行了改良，摸索了建立类似模型的一些实验方法，为2型糖尿病，特别是肥胖青少年2型糖尿病及其并发症的研究打下了基础。

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