甘丙肽重构基因GAL（intronII）的克隆及其过表达转基因载体的构建

雷小春，刘田福，司苏晋，薛亮亮，张引红

（山西医科大学实验动物中心，太原 030001）

甘丙肽（galanin，GAL）是Tatemoto等于1983年从猪小肠提取出的由29个氨基酸（人类的GAL由30个氨基酸组成）组成的羧基末端酰胺化的肽类物质，GAL广泛分布在外周和中枢神经系统，在下丘脑、海马、杏仁核、中缝背核、前脑基底皮层、室下带、嗅球以及脊髓背根神经节等区域都可检测到GAL及其受体的表达［1］。在正常生理过程GAL表达水平比较低而稳定，但是在一些病理过程中GAL表达会有异常的变化［2］。近年研究还发现GAL与阿尔茨海默病、癫痫，高泌乳血症、抑郁、神经痛等的发病机制相关，同时也与摄食、学习和记忆等功能相关［3-6］。当前对于GAL转基因模型的研究热点主要集中于GAL缺失表达或者过表达模型中某些疾病相关的生理、病理特征，定位GAL在这些生理、病理过程中的作用，而在这些研究数据的取得大多数是建立在GAL转基因模型的基础上的［7-9］。

为了研究人PDGF-β启动子调控下GAL的表达，构建GAL过表达的转基因小鼠模型，对GAL各项功能进行研究，我们构建了能够在小鼠体神经系统中广泛过量表达的GAL转基因载体，为下一步进行显微注射做好准备。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：C57BL/6小鼠由山西医科大学实验动物中心提供［SCXK（晋）2009-0001］。

1.1.2 菌株和质粒：含人血小板源性生长因子启动子片段的psisCAT6α质粒由中国协和医科大学实验动物中心秦川教授惠赠。大肠杆菌DH5a，质粒pMD-19simple，pUC18均购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.1.3 试剂：RNAiso Reagent，DNA Fragment Purification Kit，DNA A-TailingKit，DNA WideRangeDNA Marker（100-6000）购自宝生物工程（大连）有限公司；Phusion超保真聚合酶，SalI，PstI，XbaI，HindIII限制性内切酶购自NEB公司；AMV反转录酶、RNA酶抑制剂购自Promega公司；QIAquick Gel Extraction kit购自Qiagen公司，Plasmid Mini Kit购自Omega公司；X-Gal、IPTG、Amp购自Amresco公司。

1.1.4 主要引物：RT-PCR、常规PCR引物均参照GenBank中GAL基因和cDNA的标准序列，使用PrimerPremier5.0，Oligo6.72软件进行设计。重叠延伸PCR引物根据理论上得出的重叠产物重新设计：正向引物F5′AAGGCGCCGGCGATATCCGGCCTGGT CGACTGCCACGGACACGTAGAG 3′，下划线序列为SalI限制性酶切位点；反向引物R5′AACGTTTA CGAACCTGCAGCGATACGCTGCAGCATAGACG3′，下划线序列为PstI限制性酶切位点。由北京奥科生物技术有限责任公司合成。

1.2 实验方法

1.2.1 C57BL/6小鼠总RNA、基因组DNA的提取：处死小鼠，取新鲜脑组织，用RNAiso试剂和DNA提取试剂盒分别提取C57BL/6小鼠总RNA和基因组DNA，用紫外可见分光光度计检测定RNA的浓度为1.47μg/μL，纯度为1.98；DNA的浓度为0.33μg/μL，纯度为1.78。

1.2.2 扩增GAL全长cDNA：RT-PCR扩增GAL cDNA的编码部分的片段，常规PCR扩增GAL cDNA5′和3′部分非编码序列片段及GAL第二内含子，以GAL cDNA的编码部分和5′、3′部分非编码序列片段通过重叠延伸PCR的方法获得GAL的cDNA全长片段（包括编码部分、5′端和3′端部分非编码片段），分别用1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定并测序。

1.2.3 在GAL全长cDNA中插入第二内含子构建重构分子GAL（intronII）：常规PCR：GAL第二内含子需要插入的位点在GAL全长cDNA第三外显子的第15个碱基处，以插入位点两侧的25个碱基加上第二内含子两端的25个碱基共50个碱基分别作为引物，与扩增GAL全长cDNA的引物分别配对，组成两组引物将插入位点两端的片段扩增出来，即将GAL全长cDNA切成了两部分。1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定，测序。

随着水产养殖业的迅速发展，促使了其对于虾、蟹等沉性饲料持续增长的需求。面对竞争日趋激烈的市场，水产饲料生产以及水产养殖企业对于沉性水产饲料的品质要求愈发提高：饲料外观、水中稳定性、吸水透心性、饲喂效果以及饲料转化率等等，都成为评价沉性水产饲料品质优劣的标准。面对以上问题，牧羊有限公司在长期的实验研发以及实践生产过程中，对影响沉性水产饲料品质的部分因素进行了一些总结和分析。

重叠PCR：将上述步骤获得的GAL全长cDNA的两部分以及GAL第二内含子PCR产物等摩尔比混合作为重叠PCR的模板，延伸5个循环，加入引物。扩增条件：98℃预变性1min，98℃、5s，68℃、15s，72℃、50s，共25个循环，72℃延伸10min，扩增出重构基因GAL（intronII）。1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定，测序。

1.2.4 重组质粒pMD19-T Simple/GAL（intronII）的构建：胶回收GAL（intronII）片段PCR产物，进行加A反应，与pMD19-T Simple载体片段以摩尔比为3：1的比例混合，加入等体积solution I，16℃进行连接反应16h。以pMD19-T Simple载体自我连接作为阴性对照。连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，同时转化阳性对照pUC18质粒和阴性对照pMD19-T Simple载体自我连接反应液。取150μL转化菌液涂于含氨苄青霉素（100mg/L）、IPTG（20mg/mL）和X-Gal（20mg/mL）的LB平板上，37℃孵育16h，随机挑10个白色单菌落扩大培养提取质粒，经SalI、PstI分步酶切筛选阳性克隆。将含插入GAL（intronII）片段的质粒测序。

1.2.5 重组载体pUC18/PDGF-β-promoter的构建：将psisCAT6α转化到大肠杆菌中DH5a感受态细胞，37℃平板培养16h。随机挑取菌落接种在加有氨苄青霉素（100mg/mL）的5mL LB液体培养基中，37℃，225r/min振荡培养过夜。收集菌体提取质粒，电泳进行初步鉴定。鉴定后取适量psisCAT6a质粒溶液和pUC18质粒溶液用限制性核酸内切酶SalI，XbaI于37℃酶切3h。胶回收纯化PDGF-β启动子片段和线性pUC18，用Quantity One分析软件进行定量。将PDGF-β启动子片段和线性pUC18按3：1的比例16℃进行连接反应16h。以线性pUC18的自我连接作为阴性对照。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，同时转化阳性对照pUC18质粒和阴性对照线性pUC18自我连接反应液。取150μL转化菌涂于含氨苄青霉素（100mg/L）、IPTG（20mg/mL）和X-Gal（20mg/mL）的LB平板上，37℃孵育16h。随机挑10个白色单菌落扩大培养提取质粒，经XbaI和SalI双酶切筛选阳性克隆。将含PDGF启动子插入片段的质粒测序。

1.2.6 重组载体pUC18/PDGF-β-promoter/GAL（intronII）的构建：取适量的pUC18/PDGF-βpromoter质粒和pMD19-TSimple/GAL（intronII）质粒用限制性核酸内切酶SalI，PstI于37℃酶切3h，胶回收纯化GAL（intronII）片段和线型pUC18/PDGF-β-promoter，用Quantity One分析软件进行定量。将GAL（intronII）片段与线型pUC18/PDGF-β-promoter按3：1的比例16℃进行连接反应16h。以线型pUC18/PDGF-β-promoter的自我连接作为阴性对照。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，同时转化阳性对照pUC18质粒和阴性对照线性pUC18/PDGF-β-promoter自我连接反应液。取150μL转化菌涂于含氨苄青霉素（100mg/L）、IPTG（20mg/mL）和X-Gal（20mg/mL）的LB平板上，37℃孵育16h。随机挑取白色菌落扩大培养提取质粒，经XbaI和HindⅢ双酶切筛选阳性克隆。将含转基因片段PDGF-β-promoter/GAL（intronII）的质粒测序。

所有测序中美泰和生物技术（北京）有限公司完成，使用Clustalw软件对测序结果进行分析。

2 结果

2.1 GAL全长cDNA构建结果鉴定

由RT-PCR、常规PCR、重叠延伸PCR扩增得到了GAL的全长cDNA片段，序列长度为810bp，包括完整的cDNA序列699bp和两端的酶切位点（分别为55bp和56bp）。电泳鉴定PCR产物与所需扩增的目的片段长度相符（图1），测序结果与GenBank中标准序列比对，相似性达99％。

图1 GAL全长cDNA的PCR结果Fig.1 Electrophoresis of GAL full-length cDNA PCR products

2.2 重构分子GAL（intronII）构建结果的鉴定

重构分子是GAL全长cDNA分成的两部分以及第二内含子为模板重叠延伸出来的，长度为1436bp（图2）。测序结果表明重叠延伸得到片段由GAL全长cDNA和第二内含子组成，第二内含子插入的位置准确，无突变和移码。

2.3 重组质粒pMD19-T Simple/GAL（intronII）的鉴定

pMD19-T Simple/GAL（intronII）用SalI、PstI分步酶切，在电泳图中泳道1为酶切产物2.7kb和1.4kb的条带，其中2.7kp的条带即为pMD19-T Simple载体长度为2692bp，1.4kb的条带为GAL（intronII）长度1436bp。泳道2为没有酶切的pMD19-T Simple/GAL（intronII）（图3）。测序证明酶切得到的条带即为pMD19-T Simple载体和重构分子GAL（intronII）。

图2 重构分子GAL（intronII）的PCR结果Fig.2 Electrophoresis of GAL（intronII）PCR products

图3 质粒pMD19-T Simple/GAL（intronII）酶切鉴定Fig.3 Electrophoresis of enzyme digestion of plasmid pMD19-T Simple/GAL（intronII）

2.4 重组质粒pUC18/PDGF-β-promoter的鉴定

以XbaI和SalI双酶切重组质粒pUC18/PDGF-β-promoter，在电泳图中泳道1为酶切产物2.7kb和1.5kb的条带，其中2.7kb的条带为PUC18载体长度为2686bp，1.5kb的条带为PDGF-β启动子片段长度为1486bp。测序结果证明酶切得到的条带即为PDGF-β启动子片段（图4）。测序结果与Gene Bank中标准序列比对，相似性达100％。

图4 质粒PUC18/PDGF-β-promoter酶切鉴定Fig.4 Electrophoresis of enzyme digestion of the recombined plasmid PUC18/PDGF-β-promoter

2.5 重组载体pUC18/PDGF-β-promoter/GAL（intronII）的鉴定

以XbaI和HindIII双酶切重组质粒pUC18/PDGF-β-promoter/GAL（intronII），在电泳图泳道1为酶切产物2.7kb和3.0.kb的条带，其中2.7kb的条带为PUC18载体长度为2686bp，3.0kb的条带为1486bp dePDGF-β启动子和1436bp的GAL（intronII）片段连接而得到的转基因片段（图5）。测序结果与理论上的重组片段进行比对，相似性达到99％。

图5 质粒PUC18/PDGF-β-promoter/GAL（intronII）酶切鉴定Fig.5 Electrophoresis of enzyme digestion of the recombined plasmid PUC18/PDGF-βpromoter/GAL（intronII）

3 讨论

本实验参照了Holmberg和Kuteeva等的方法，在GAL全长cDNA插入第二内含子，但是插入的位点不同［6］。根据Barbara等发表的研究，GAL cDNA的第一外显子是非编码序列，第二外显子编码了27个碱基的前导序列，第三外显子的前15个碱基编码了信号序列。第三外显子的后39碱基和第四、五，六外显子编码了GAL和GAL相关肽（GMAP），第六外显子的后150个碱基为非编码序列［10］。本研究中尝试运用重叠延伸PCR方法扩增的嵌入第二内含子的GAL全长cDNA的是一种嵌合分子，自然不存在，但是并没有打乱其基因表达框。早在上世纪80年代Rochester等在进行转基因植物和动物的研究中已经开始在cDNA中插入一段内含子以增强其表达。试验表明异源内含子（特别是第一、二内含子）可提高外源基因（特别是以cDNA为表达构件）的表达效率［11，12］。Palmiter等进行的转基因试验了发现含有内含子时能比cDNA的表达水平提高5～75倍［13］。而国内学者卢一凡等的研究也得出类似的结论，并且证明了内含子插入的位置对转基因的表达没有影响［14］。

本实验尝试了将PCR扩增技术应用于DNA片段连接。一般情况下采用限制性内切酶位点连接DNA。本研究在扩增GAL全长cDNA和将第二外显子插入cDNA时采用了重叠延伸PCR。这样既不需要考虑内切酶位点，连接效率高，同时也没有引入额外碱基，保持了正确的读码框，有利于基因表达。实验进行了两次重叠，第一次重叠是以cDNA的3个片段为模板的，所以扩增出的片段使重叠部分非常长，5′和3′重叠的部分分别为83bp和109bp，重叠延伸能有效进行；第二次重叠时内含子和切开的cDNA片段的引物中均为重叠部分故有两端都有50bp的重叠部分，重叠也能有效进行。

大量的研究表明GAL在神经生理学过程包括对促性腺激素的神经内分泌的调节、生长激素的分泌、认知功能和癫痫易感性等过程起了重要作用。近几年来GAL转基因动物模型被不同领域的研究人员用于各种生理病理研究，如疼痛、癫痫、空间学习能力等［15-17］。前期，人们对GAL模型的研究热点主要集中于阐明这些GAL缺失表达或者过表达模型中某些疾病相关的生理、病理特征［18］。最近，研究者们开始探索GAL在生理病理过程中的作用机制［19］。GAL的功能是通过GAL受体GALR1，GALR2，GALR3中的一个或多个介导的，基于研究的需要，研究人员对GAL受体进行基因修饰构建GALR基因敲除模型［20-22］。随着GAL研究的深入，Lang R提出了GAL家族，包括GAL、GMAP、GAL样肽、alarin和GAL受体家族［23］。

本研究构建的转基因载体采用一个在神经生理学模型研究应用较为成熟和广泛的血小板源性生长因子β链启动子来控制GAL在神经系统中过量表达，为构建一个有效的GAL过表达转基因，模型进行GAL的研究奠定了重要的基础。

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