糖皮质激素对机械通气大鼠肺组织iNOS、NO表达的影响

2011-02-16 14:55张新日
中国比较医学杂志 2011年1期
关键词:潮气量皮质激素炎性

刘 芳,张新日,张 岩

(山西医科大学第一临床医学院呼吸科,太原 030001)

呼吸机所致肺损伤(ventilator induced lung injury,VILI)是影响机械通气临床疗效的一个重要因素,研究VILI的发生机制和防治措施对提高机械通气的应用水平以及危重症患者的救治水平均具有重要意义[1]。本研究拟通过动物试验,探讨糖皮质激素对大潮气量机械通气大鼠肺组织诱导型一氧化氮合酶(iNOS)及一氧化氮(NO)表达的干预作用。

1 材料和方法

1.1 动物分组与模型制备

雄性健康Wistar大鼠24只(山西医科大学实验动物中心提供)[SCXK(晋)2009-001],体重310~380g,随机分为3组①对照组:未行机械通气;②机械通气组:VT=40mL/kg;③地塞米松干预组:VT=40mL/kg,通气前1h经腹腔注入DXM(6mg/kg)。

用25%乌拉坦4mL/kg腹腔注射将大鼠麻醉后行气管切开。除对照组外,其余大鼠均通过胶管与动物人工呼吸机(DH-150型,浙江大学医学仪器厂制造)连接,进行机械通气。各组大鼠的通气参数除潮气量外,其余参数均相同,即I∶E=1∶3,FiO2=21%,F=60次/min,通气时间为90min。

通气结束后经腹主动脉取血2~3mL,肝素钠抗凝,离心取上清液置于EP管中,-80℃冻存备用。然后将大鼠放血处死,切取肺脏。在无菌状态下取右肺上叶置于已消毒的EP管中,-80℃冰箱保存,用于RT-PCR及肺组织NO测定。取右肺下叶以10%中性福尔马林灌注固定,24h后行常规石蜡包埋,用于HE及免疫组织化学染色。

1.2 RT-PCR法检测肺组织iNOSmRNA的表达

用Trizol(TaKaRa宝生物工程有限)提取肺组织总RNA,以大鼠GAPDH(磷酸甘油醛脱氢酶)作为内参。大鼠iNOS及内参引物由北京奥科生物技术有限公司合成。大鼠iNOS及内参(GAPDH)引物由北京奥科生物技术有限公司合成。iNOS上游引物:5’-GGC TCC AGC ATG TAC CCT-3’;下游引物:5’-TCC TGC CCG CTG AGT TCG T-3’;反应条件:95℃预变性4min,95℃变性30s,55℃复性30s,70℃延伸30s,30个循环,最后70℃延伸2min。GAPDH上游引物:5’-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3’;下游引物:5’-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3’;反应条件:95℃预变性4min,95℃变性30s,59℃复性30s,70℃延伸30s,30个循环,最后70℃延伸5min。取PCR产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳,用天能2500凝胶图像分析系统扫描条带密度,以目的基因光密度值与内参光密度值的比值表示肺组织iNOS mRNA的相对表达量。

1.3 肺组织iNOS免疫组织化学染色

采用链霉素亲和-生物素-过氧化酶复合物(SABC)法检测大鼠肺组织iNOS蛋白表达。操作步骤按试剂盒说明(购自武汉博士德生物有限公司)进行。兔抗大鼠抗体工作浓度为1∶50,以PBS(磷酸盐缓冲液)代替一抗作阴性对照。

结果判断:阳性表达为细胞质呈棕褐色,阳性表达细胞多集中于细支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞。采用MIAS-2000医学图像分析系统检测每个高倍视野(40×10)的目标平均灰度(GO)、视场平均灰度(GV)和面积密度(AAR),并计算出阳性单位,即PU=[∣GO-GV︱×100]/[(1-AAR)×Gmax],其中Gmax为最大灰度(255)[1]。

1.4 肺组织和血浆NO测定

采用硝酸还原酶法测定肺组织和血浆NO含量,方法及操作步骤按试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)说明进行。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 肺组织iNOS mRNA及其蛋白表达

各组大鼠肺组织iNOS mRNA及其蛋白表达测定结果见表1和图1~5。结果显示,机械通气组和DXM干预组肺组织iNOS mRNA及其蛋白表达水平均明显高于对照组(P<0.01),而DXM干预组肺组织iNOS mRNA及其蛋白表达水平较机械通气组明显降低(P<0.01)。

表1 各组大鼠肺组织iNOSmRNA及其蛋白表达Tab.1 The expression of iNOS mRNA and proteinum in lung in groups

图1 各组大鼠肺组织iNOS mRNA表达(RT-PCR)Fig.1 The expression of iNOS mRNA in lung tissue in groups(RT-PCR)

图2 机械通气组大鼠肺组织弥漫性肺间质水肿和炎性细胞浸润Fig.2 Different levels of interstitial and alveolar edema,infiltration and activation of inflammation cells could be seen in ventilation group

图3 对照组大鼠肺组织iNOS蛋白(SABC)Fig.3 iNOS protein in lung tissue in control group(SABC)

2.2 血浆和肺组织NO测定

各组大鼠血浆和肺组织NO含量测定结果见表2。结果显示:机械通气组和DEX干预组血浆和肺组织NO含量均明显高于对照组(P<0.01),而DXM干预组血浆和肺组织NO含量较机械通气组明显降低(P<0.01)。

图4 机械通气组大鼠肺组织iNOS蛋白(SABC)Fig.4 iNOS protein in lung tissue in ventilation group(SABC)

图5 DXM干预组大鼠肺组织iNOS蛋白(SABC)Fig.5 iNOS protein in lung tissue in DXM group(SABC)

表2 各组大鼠血浆和肺组织中NO含量Tab.2 NO in lung and blood in groups

3 讨论

呼吸机所致肺损伤(ventilator induced lung injury,VILI)是影响机械通气临床疗效的一个重要因素,其发病机制相当复杂,涉及面非常广泛,是目前医学界研究的热点之一[2]。研究表明,大潮气量机械通气可引起炎症细胞在局部肺组织聚集、活化,并释放多种炎性介质和细胞因子[3]。这些炎性介质和细胞因子不但可直接造成肺组织损伤,还可激活更多的炎性细胞释放炎性介质或细胞因子,从而形成瀑布效应,使机体损害因素进一步放大。本研究结果显示,机械通气组大鼠肺组织可见弥漫性肺间质水肿和炎性细胞浸润,进一步证实大潮气量机械通气可导致急性肺损伤的发生。

一氧化氮(nitric oxide,NO)是由多种细胞产生的广泛存在于生物体内的小分子物质,体内NO主要由一氧化氮合酶(NOS)催化生成。NOS依其激活条件可分为固有型(cNOS)和诱导型(iNOS)两种类型[4,5]。正常时,cNOS催化体内生成少量NO,具有多种重要的生理功能。在病理条件下,由iNOS诱导产生的大量NO则可作为一种炎性介质参与多种疾病(如支气管哮喘、急性呼吸窘迫综合征)的发病过程,日益受到了人们的关注[6,7]。然而,NO是否参与VILI的发生过程,目前文献报道甚少。本实验结果显示,机械通气组大鼠肺组织iNOS mRNA及其蛋白表达水平,以及血浆和肺组织NO含量均明显高于对照组,说明大潮气量机械通气可诱导局部肺组织iNOS高表达而合成大量NO,后者不但具有细胞毒性作用,还可参与体内氧自由基形成,促进体内炎症反应,从而直接和间接引起肺组织损伤[2]。

糖皮质激素(glucocorticoids,GCs)是一种药理作用广泛的药物,对非特异性炎症反应具有明显抑制作用。研究表明,GCs不但能抑制PMN和血小板聚集、活化,还能促进肺表面活性物质的合成,稳定溶酶体膜,减少溶酶体酶及相关介质的释放,因而很早就用于ALI/ARDS的治疗[8,9]。近年来,GCs对iNOS及NO的作用逐渐被人们所认识。有人在LPS诱导的急性肺损伤动物实验中采用逆转录-聚合酶链反应技术证明,地塞米松可使肺组织iNOS mRNA表达量明显减少,且具有剂量相关性,提示GCs可在转录水平上抑制iNOS的活性,从而减少NO的生成[10]。本实验结果显示,DXM干预组大鼠肺组织iNOS mRNA及其蛋白表达水平,以及血浆和肺组织NO含量均较机械通气组明显降低,说明糖皮质激素可通过抑制肺组织iNOS的表达,减少NO生成,对机械通气大鼠肺组织具有一定保护作用。然而,糖皮质激素究竟通过何种途径抑制肺组织iNOS表达,目前尚不清楚,推测其作用可能与其抑制PMN等炎症细胞活化及释放炎性介质有关,但其具体作用机制还有待进一步研究[11]。

综上所述,机械通气可使肺泡上皮及毛细血管内皮细胞受到过度牵拉,导致气血屏障结构受损,使炎症细胞、炎性介质和细胞因子构成的调节网络失控,从而诱导iNOS mRNA及其蛋白高表达,产生大量内源性NO而引起肺组织损伤。糖皮质激素可通过抑制肺组织iNOS mRNA及其蛋白的表达,减少NO的生成,对VILI具有一定防治作用。

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