用于神经突导向研究的螺旋神经元培养体系初步观察△

李树峰 王正敏 李雯

·基础研究·

用于神经突导向研究的螺旋神经元培养体系初步观察△

李树峰 王正敏 李雯＊

目的探寻适用于螺旋神经元神经突导向研究的螺旋神经元培养体系。方法取新生SD大鼠的螺旋神经节，分别进行分离培养和组织块培养，比较神经突的生长模式。组织块培养时，采用不同底物(包括多聚赖氨酸、层粘连蛋白和I型胶原蛋白等)铺片，观察对螺旋神经元组织块贴壁和神经突生长的影响。用微管相关蛋白2(MAP2)抗体和微管聚合蛋白1(Tau-1)抗体鉴别神经突的极性。结果组织块培养体系中，部分神经突长出细胞毯，在无干扰的环境中生长。以多聚赖氨酸加层粘连蛋白为底物铺片时，组织块贴壁率高，神经突数量多、生长较快，有利于获取更多适于神经突导向研究的神经突。培养体系中的神经突可被Tau-1抗体标记，而不能被MAP2抗体标记。结论在多聚赖氨酸加层粘连蛋白包被的可移动玻片上，进行螺旋神经元组织块培养获取自由神经突的方法适合螺旋神经元神经突的导向研究。(中国眼耳鼻喉科杂志，2011，11：82-85)

螺旋神经元；神经突导向；神经突；组织块培养；多聚赖氨酸；层粘连蛋白

螺旋神经元是一种将Corti器转换产生的电信号向中枢传递的双极神经元，也是人工耳蜗植入后将言语处理器转换编程的电信号向大脑传递的关键途径。重度和极重度感音神经性聋往往有原发或继发的螺旋神经元退行性变，包括螺旋神经元数量减少及周围突退缩和减少等[1-3]，从而影响人工耳蜗植入后的效果[4-6]。多种因素可促进螺旋神经元神经突的再生，然而体内实验研究表明，神经突的再生方向是无序的，并非总是朝鼓阶和基底膜方向[7]。神经突的导向研究不仅需要单离的神经突，而且由于神经突与导向因子来源之间的方位可以任意调整，还需有活细胞长时间观察和记录装置。关于螺旋神经元神经突导向的相关研究虽有少量报道，然而均没有建立能满足上述要求的培养体系[8-11]。为探寻这样一种培养体系，本研究比较了分离培养和组织块培养时螺旋神经元神经突的不同生长模式，以及不同培养底物对组织块培养的螺旋神经元神经突生长的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 分别采取组织块培养和分离培养两种方法培养螺旋神经元，观察螺旋神经元神经突的生长模式；观察采用不同底物进行组织块培养对组织块贴壁和神经突生长情况的影响。实验采取成组设计。

培养玻片的包被：直径14 mm的圆形玻片经酸洗，然后以蒸馏水和无水乙醇先后漂洗，再经干热灭菌后备用。底物包被在超净台中进行，分为以下5组：①层粘连蛋白组(L组)：20 μg/mL层粘连蛋白(L2020， Sigma-Aldrich，美国)40 μL均匀涂布在每个玻片上，置于37 ℃温箱中2 h后，用磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline,PBS)漂洗3次，然后置超净台中晾干备用； ②多聚赖氨酸组(P组)：100 μg/mL多聚赖氨酸(P7405，Sigma-Aldrich，美国)40 μL均匀涂布在每个玻片上，置于4 ℃冰箱中过夜后，用PBS漂洗3次，然后置超净台中晾干备用；③多聚赖氨酸加层粘连蛋白组(P+L组)：玻片先用多聚赖氨酸后，用层粘连蛋白按上述方法处理；④I型胶原蛋白组(C组)：300 μg/mL I型胶原蛋白(C3867，Sigma-Aldrich，美国)40 μL均匀涂布在每个玻片上，置于4 ℃冰箱中过夜后，用PBS漂洗3次，然后超净台中晾干备用； ⑤I型胶原蛋白加层粘连蛋白组(C+L组)：玻片先用I型胶原蛋白后，用层粘连蛋白按上述方法处理。

1.2 螺旋神经节的解剖 将出生4～6 d的新生SD大鼠断头后取出颞骨，置于0～4 ℃的PBS中。打开耳囊，去除血管纹、基底膜、蜗神经和蜗轴骨质，将剩余的蜗轴剪成300～400 μm的组织块。

1.3 螺旋神经元的培养 ①组织块培养：培养液为DMEM/F12(10565018，Invitrogen，美国)加B27和N2添加剂(17504-044，17502-048，Invitrogen，美国)。将3块螺旋神经节组织块分别移放于培养皿中的玻片上，加入培养液至刚没过组织块，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养12 h，待其贴壁后再添加培养液继续培养48 h。上述不同培养底物组中，每组10个玻片，每片3个组织块，共30个组织块。分别计数贴壁生长的组织块数量。②分离培养：螺旋神经节组织块在37 ℃的0.25%胰蛋白酶消化30 h，吹打数下至组织块分散。加入胎牛血清至含量10%，静置10 min终止消化。取上层细胞混悬液离心(4 ℃、200×g、3 min)。弃上清液，加入培养液重悬、混匀，约每6个蜗轴加1.5 mL培养液。细胞悬液接种于培养皿内多聚赖氨酸加层粘连蛋白包被的玻片上，密度为200 μL/cm2，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养6 h待贴壁，而后添加培养液继续培养48 h。

1.4 螺旋神经元及其神经突的免疫荧光鉴定 培养玻片用PBS漂洗后，用-10～-20 ℃的甲醇固定15 min。PBS漂洗后，用1%山羊血清封闭30 min。再用神经丝蛋白(neurofilament，NF)抗体(1∶500，200 kD，N4142，Sigma-Aldrich，美国)室温下作用1 h，PBS漂洗后用Alexa Fluor 488荧光二抗(1∶800，Molecular Probes，A-11008)作用1 h。PBS漂洗后再先后用胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗体(1∶200，G6171，Sigma-Aldrich，美国)和Alexa Fluor 555荧光二抗(1∶500，Molecular Probes，A-21422)作用1 h。最后用4′,6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐(C1002，Beyotime，美国)作用1 h，以显示细胞核。最后在倒置荧光显微镜下观察，计数组织块中的神经突总数和已长出组织块周边细胞毯的神经突数量。用AxioVision 4.6.3软件测量神经突长度。

为区分神经突极性，用微管相关蛋白2(microtubule associated protein 2,MAP2)抗体和微管聚合蛋白(Tau-1)抗体分别标记螺旋神经元周围突和中枢突。培养组织块按上述方法经固定、封闭后，先后用Tau-1抗体(1∶500，MAB3420，Millipore，美国)和IgG-TRITC荧光二抗(1∶200，T5393，Sigma-Aldrich，美国)分别在室温下作用1 h。再先后用MAP2抗体(1∶800，Abcam,Cambridge，ab11267，英国)和Alexa Fluor 488荧光二抗(1∶800) 分别在室温下作用1 h。最后在倒置荧光显微镜下观察。

1.5 统计学处理 采用SPSS11.0统计学软件，具体方法包括χ2检验和方差分析，以Plt;0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 培养方法对神经突生长的影响 在螺旋神经元的组织块培养和分离培养体系中，主要有螺旋神经元、成纤维细胞和神经膜细胞(雪旺细胞)。螺旋神经元通常有2个或2个以上细长突起，即神经突；神经膜细胞一般也有长突起形成。但是，螺旋神经元的神经突较细且粗细均一，有曲张体和生长锥等特征性结构；而神经膜细胞的神经突较粗，在胞体的起始部位突起有明显由粗变细的特征。成纤维细胞通常有不规则的胞体，有时也有较短的突起。在分离培养体系中，上述突起往往混杂在一起，或者被细胞体遮盖，在相差显微镜下难以辨别(附3页图1)。在组织块培养体系中，大部分神经突也生长在组织块周围的细胞毯中，难以在相差显微镜下辨认。但是有少部分神经突进入细胞毯外的“洁净”环境中生长，称为“自由神经突”[12]。这时，在神经突的生长方向及其周围没有其他细胞和突起的干扰，而且在相差显微镜下依据其上的曲张体和生长锥等结构特点即可辨认。在这些“自由神经突”的胞体端，通常有神经膜细胞伴随生长(附3页图2)。

2.2 培养底物对神经突生长的影响 ①采用不同底物进行螺旋神经元的组织块培养时，组织块的贴壁情况各不相同(附3页图3)。组织块贴壁比率分别为：L组60.0%(18/30)、 P组83.3%(25/30)、P+L组86.7%(26/30)、C+L组100%(30/30)和 C组93.3%(28/30)，经χ2检验，P组、P+L组、C组、C+L组各组间差异均无统计学意义(P值均gt;0.05)，上述各组与L组之间的差异均有统计学意义(P值均lt;0.05)。②各组织块长出的神经突平均数量分别为：L组8.7(156/18)、P组7.9(197/25)、P+L组7.8(203/26)、C+L组2.2(65/30)和C组1.1(30/28)，P组、L组和P+L组各组与C组、C+L组各组之间差异均有统计学意义(P值均lt;0.05)。③各组织块长出的“自由神经突”的平均数量分别为：L组0.56(10/18)、P组0.44(11/25)、P+L组0.65(17/26)、C+L组0.07(2/30)和C组0(0/28)，P组、L组和P+L组各组与C组、C+L组各组之间差异均有统计学意义(P值均lt;0.05)。④“自由神经突”的平均长度分别为：L组(760.21±43.11)μm、P组(553.95±32.79)μm、P+L组(829.57±55.39)μm，L组和P+L组两组与P组之间差异均有统计学意义(P值均lt;0.05)，L组与P+L组间差异无统计学意义。除标明的之外，上述各组间比较均采用方差分析。

2.3 “自由神经突” 培养有“自由神经突”的圆形小玻片可用小镊子移入活细胞长时间观察系统中的培养装置内。玻片的方位可以任意调整，以使神经突与产生或释放神经突导向信号的装置(如电极或毛细玻璃管等)之间形成特定的方位，利于神经突的导向研究。培养有“自由神经突”的玻片移入螺旋神经元神经突电场导向研究系统中，后者由自动定时拍摄的倒置相差显微镜和带有温度和CO2控制活细胞的培养观察装置以及安装电极并连接电流发生装置的培养皿组成[12]。可用细针调整玻片的方位，使神经突末端方位与电场方向之间形成特定角度，观察神经突在不同电场作用下的生长偏向性。

2.4 神经突的极性 组织块培养体系中的神经突包括“自由神经突”可被Tau-1抗体标记，而不能被MAP2抗体标记。成纤维细胞和神经膜细胞的胞体和突起均不能被两者标记(附4页图4)。

3 讨论

3.1 培养方法对神经突生长的影响 分离培养是通常采用的培养体系，如鸡胚背根神经节细胞和非洲爪蟾胚胎脊髓神经元的分离培养等[13-15]。神经突的导向研究需要单离的神经突，其生长延伸应处于无其他细胞和物质阻挡和干扰的洁净环境；同时还应有足够的空间在神经突周围放置释放导向因素的装置，如微电极和毛细玻璃管等。然而分离培养的螺旋神经元培养体系中，螺旋神经元的神经突与神经膜细胞和成纤维细胞混杂在一起，在相差显微镜下无法辨认；而且神经突的周围和延伸方向上的细胞成分将对神经突的延伸形成干扰，因而影响导向因素作用的分析。在以往关于螺旋神经元神经突生长的相关研究中，更常采用组织块培养的方法[8-11]。在这些研究中，采用微图形化导向因子研究对培养在其上神经突的导向作用，即将不可溶的导向因子包被在培养底物上，使之成边界、条带或斑块的微图形。可溶性的导向因子则以离散的液体浓度或由固定位置细胞释放的形式研究其导向作用。然而，由于神经突由胞体发出的部位是不可预知的、不均匀的，也是无法确定的，因而难以准确判断分析神经突生长的偏转情况，影响神经突导向研究的精确性和效率。此外，神经突导向研究中普遍应用的必要工具——活细胞长时间观察记录装置，在这些研究中没有采用，因而难以确定神经突的生长过程中是否受到干扰或阻碍。

在作者的前期研究中已证实，采用组织块培养获取的“自由神经突”可在相差显微镜下依据形态进行辨认；培养于可移动玻片上的“自由神经突”可针对导向因子释放装置任意调整方位[12]。这种可移动玻片上的神经突不仅适合螺旋神经元的神经突导向研究，也有助于其他神经元的神经突导向研究。

3.2 不同培养底物对神经突生长的影响 本研究比较了3种常用的细胞培养底物对螺旋神经元组织块贴壁和神经突生长的影响，结果表明，培养底物不仅影响组织块的贴壁，而且影响神经突的生长。近几年，I型胶原蛋白广泛应用于神经细胞三维培养体系的构建[16-18]。在本研究中，使用I型胶原蛋白或I型胶原蛋白加层粘连蛋白作为底物时，螺旋神经元的组织块更容易贴壁。但是，神经突的长出数量和生长速度均较差，这表明I型胶原蛋白不适合作为底物培养螺旋神经元。多聚赖氨酸和层粘连蛋白是常用的细胞培养底物。以往研究表明，层粘连蛋白作为培养底物能促进螺旋神经元神经突的生长，而且随着包被浓度的增加，神经突的数量和长度逐渐增加[19]。单纯层粘连蛋白作为底物时，组织块的贴壁率较低，但“自由神经突”的数量和神经突的生长情况能够满足神经突导向研究的需要。相反，多聚赖氨酸作为底物时，“自由神经突”的数量较少，神经突的生长速度较慢，但组织块的贴壁率较高。而预先包被多聚赖氨酸，再包被层粘连蛋白可以增加组织块的贴壁率，同时又能获得较多生长良好的“自由神经突”，是适合神经突导向研究的螺旋神经元培养底物。

3.3 神经突的极性 为确定本研究中组织块培养体系中神经突的极性，我们使用MAP2抗体和Tau-1抗体来进行免疫荧光标记，结果神经突可被Tau-1标记而不能被MAP2标记。然而这并不能完全断定本研究中的神经突为轴突。MAP2抗体和Tau-1抗体分别是广泛使用的树突和轴突标记物，是目前鉴别神经突极性的通用标记物。有研究表明，在鸡体内的前庭耳蜗神经中，MAP2抗体能够标记胞体和周围突，而不能标记中枢突；然而在分离培养体系中(如培养的背根神经节)，MAP2抗体能够标记的只有神经突的起始部分和胞体[20-21]。在体内，Tau-1 抗体只能标记神经元轴突，而不能标记胞体和树突以及其他种类的细胞[22]。然而体外培养的海马神经元的轴突、胞体和树突都能够被Tau-1抗体标记[23]。这些研究表明，体外培养神经元的神经突与体内的神经突不同，能够被Tau-1标记，而不能被MAP2标记，可能是极性没有发育成熟的神经突。其他研究也表明，体外培养神经元的神经突可发育成树突，也可发育成轴突，成熟和发育中的神经元树突也能够转化为轴突[24]。因而，本研究中神经突可能也是极性未发育成熟的神经突。

[1]Kerr A,Schuknecht HF.The spiral ganglion in profound deafness[J].Acta Otolaryngol,1968,65(6):586-598.

[2]Otte J,Schunknecht HF,Kerr AG.Ganglion cell populations in normal and pathological human cochleae.Implications for cochlear implantation[J].Laryngoscope,1978,88(8):1231-1246.

[3]Nadol JB,Young YS,Glynn RJ.Survival of spiral ganglion cells in profound sensorineural hearing loss:implications for cochlear implantation[J].Ann Otol Rhinol Laryngol,1989,98(6):411-416.

[4]Shepherd RK,Javel E.Electrical stimulation of the auditory nerve.I.Correlation of physiological responses with cochlear status[J].Hear Res,1997,108(1-2):112-144.

[5]Hardie NA,Shepherd RK.Sensorineural hearing loss during development:morphological and physiological response of the cochlea and auditory brainstem[J].Hear Res,1999,128(1-2):147-165.

[6]Shepherd RK,Roberts LA,Paolini AG.Long-term sensorineural hearing loss induces functional changes in the rat auditory nerve[J].Eur J Neurosci,2004,20(11):3131-3140.

[7]Wise AK,Richardson R,Hardman J,et al.Resprouting and survival of guinea pig cochlear neurons in response to the administration of the neurotrophins brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3[J].J Comp Neurol,2005,487(2):147-165.

[8]Evans AR,Euteneuer S,Chavez E,et al.Laminin and fibronectin modulate inner ear spiral ganglion neurite outgrowth in an in vitro alternate choice assay[J].Dev Neurobiol,2007,67(13):1721-1730.

[9]Ryan AF,Wittig J,Evans A,et al.Environmental micro-patterning for the study of spiral ganglion neurite guidance[J].Audiol Neurootol,2006,11(2):134-143.

[10]Anderson M,Boström M,Pfaller K,et al.Structure and locomotion of adult in vitro regenerated spiral ganglion growth cones—a study using video microscopy and SEM[J].Hear Res,2006,215(1-2):97-107.

[11]Brors D,Bodmer D,Pak K,et al.EphA4 provides repulsive signals to developing cochlear ganglion neurites mediated through ephrin-B2 and -B3[J].J Comp Neurol,2003,462(1):90-100.

[12]Li S,Li H,Wang Z.Orientation of spiral ganglion neurite extension in electrical fields of charge-balanced biphasic pulses and direct current in vitro[J].Hear Res,2010,267(1-2):111-118.

[13]Patel N,Poo MM.Orientation of neurite growth by extracellular electric fields[J].J Neurosci,1982,2(4):483-496.

[14]Rajnicek AM,Foubister LE,McCaig CD.Temporally and spatially coordinated roles for Rho,Rac,Cdc42 and their effectors in growth cone guidance by a physiological electric field[J].J Cell Sci,2006,119(Pt 9):1723-1735.

[15]McCaig CD,Rajnicek AM,Song B,et al.Controlling cell behavior electrically:current views and future potential[J].Physiol Rev,2005,85(3):943-978.

[16]Edelman DB,Keefer EW.A cultural renaissance:in vitro cell biology embraces three-dimensional context[J].Exp Neurol,2005,192(1):1-6.

[17]Kofron CM,Fong VJ,Hoffman-Kim D.Neurite outgrowth at the interface of 2D and 3D growth environments[J].J Neural Eng,2009,6(1):16002.

[18]Graves CE,McAllister RG,Rosoff WJ,et al.Optical neuronal gui-dance in three-dimensional matrices[J].J Neurosci Methods,2009,179(2):278-283.

[19]Aletsee C,Mullen L,Kim D,et al.The disintegrin kistrin inhibits neurite extension from spiral ganglion explants cultured on laminin[J].Audiol Neurootol,2001,6(2):57-65.

[21]San josé I,Vzquez E,Garcia-Atares N,et al.Differential expression of microtubule associated protein MAP-2 in developing cochleovestibular neurons and its modulation by neurotrophin-3[J].Int J Dev Biol,1997,41(3):509-519.

[22]Binder LI,Frankfurter A,Rebhun LI.The distribution of tau in the mammalian central nervous system[J].J Cell Biol,1985,101(4):1371-1378.

[23]Dotti CG,Banker GA,Binder LI.The expression and distribution of the microtubule-associated proteins tau and microtubule-associated protein 2 in hippocampal neurons in the rat in situ and in cell culture[J].Neuroscience,1987,23(1):121-130.

[24]Witte H,Bradke F.The role of the cytoskeleton during neuronal polarization[J].Curr Opin Neurobiol,2008,18(5):479-487.

2011-01-05)

(本文编辑 杨美琴)

Neuritesofspiralganglionneuronssuitingforneuriteguidanceinvestigationinvitro

LIShu-feng,WANGZheng-min,LIWen＊.DepartmentofOtolaryngology,EyeEarNoseandThroatHospital,FudanUniversity,Shanghai200031,China

Corresponding author：WANG Zheng-min,Email:fjswzm@gmail.com

ObjectiveTo investigate a method of cell culture suiting for neurite guidance research of spiral ganglion neurons.MethodsThe authors explored the extension and development of spiral ganglion neurites from neonatal Sprague-Dawley rats by either explant culture or disassociated culture.In addition,the impact of different substratums(including poly-D-lysine,laminin and collagen I) on neurite extension was studied.To differentiate dendrites and axons,immunofluorescence for microtubule associated protein 2(MAP2) and Tau-1 was observed.ResultsThere were a few neurites that grew out of the cell blanket to a clean area in the explant culture of spiral ganglion neurons on movable slides.The direction of neurite extension appeared random because there was no interference from other cells,which was a characteristic suiting for the investigation of neurite guidance.Explants on poly-D-lysine plus laminin had relatively higher adhesion ratio,more and longer “free” neuritis than explants on other substratum.The neurites in the spiral ganglion explants could be labeled by anti-Tau-1 but not anti-MAP2.ConclusionsIncubating free neurites on poly-D-lysine plus laminin-coated movable slides was suitable for neurite guidance research of spiral ganglion neuronsinvitro.The polarity of neurites in explant culture system was immature.(Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2011,11:82-85)

Spiral ganglion neuron; Axon guidance; Neurite; Explant culture; Poly-D-lysine; Laminin

上海市卫生局青年科研项目资助(2008Y100)

复旦大学附属眼耳鼻喉科医院耳鼻喉科

＊实验中心上海 200031

王正敏(Email:fjswzm@gmail.com)