三种中药复方制剂对鸡MD的影响及其机制的研究

汉丽梅 王晓峰 孙娜 张金路 谷永生 孔延飞

在饲料中广泛添加抗生素、激素等药物防病治病及提高生产性能[1]，在为现代畜牧养殖带来可观的经济效益的同时，却对产品的质量产生了影响，增加了畜产品中药物残留的风险，可能会危害人类的健康。许多研究都发现中草药具有无残留、无抗药性、无毒副作用、无污染并能显著提高动物的生产性能、提高动物的抗病能力的特点[2-7]，使科技工作者越来越关注中草药在动物生产中的应用研究。

鸡马立克氏病（Marek's Disease,MD）是由马立克病毒(Marek's Disease virus,MDV)引起的一种淋巴组织增生性疾病[8],是很好的动物病毒型肿瘤的研究模型。应用人类广泛应用的具有抗病毒作用的三种中药复方:复方制剂1[9]、复方制剂2[10]、复方制剂3[11]，并对配方进行调整，进行了抗MDV感染的作用效果及其可能机理的研究与探讨，为开发在畜牧生产中具有应用前景的无药物残留的中药抗病毒制剂，提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1日龄鸡雏（无基础免疫）由沈阳农业大学实验鸡场提供。MDV京-1株血毒由哈尔滨兽医研究所馈赠。

1.2 方法

1.2.1 MD模型的建立

1日龄雏鸡腹腔接种MD病毒0.22 ml/只，建立MD动物模型。空白对照组腹腔注射等量的生理盐水。

1.2.2 中药复方添加剂的加工与处理

中药复方1主要以免疫促进作用、抗应激作用、抗氧化作用的山茱萸、茯苓等成分为主；中药复方2主要以白芍、川芎等保肝养血成分为主；中药复方3主要以黄连、黄柏等抗炎抑菌的成分为主。三种中药复方按照药方进行配制，并研磨成粉，药粉经80目网筛筛选后，按0.5%添加量将复方制剂添加于饲料中。

1.2.3 试验分组与给药方式及样品收集

180只1日龄雏鸡随机分空白对照组、攻毒对照组、攻毒试验组(复方1组、复方2组、复方3组)。采用拌料给药的方式，按设计的比例将复方制剂添加于饲料中。攻毒后，试验组立即给药，给药期为14 d。给药期结束后，在停药后0、14、28 d进行采样。

1.2.4 血清生化指标的检测与分析

血清总超氧化物歧化酶（SOD）的测定采用黄嘌呤氧化酶法测定，结果计算以每毫升反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个亚硝酸盐单位（NU）[12]；血清丙二醛（MDA）的测定采用过氧化脂质降解产物中的MDA可以与硫代巴比妥（TBA）缩合，形成红色产物，此产物在532 nm处有最大吸收峰。端粒酶活性测定采用改进的Trap法进行端粒酶活性的测定[13]。应用模版序列(R5:TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG)为阳性对照，PCR引物序列（P1：5’-TCACC TTGTA ATCCG ATCCG TCGAGCAGAGTT-3’；P2：5’-CAACA TCTCC ACTAC CTTCT AACCG TAACC-3’），银染法鉴定，Bandscan软件处理图像，进行活性分析。采用MTT法测定T淋巴细胞转化率；免疫器官指数比的计算：脾脏、胸腺、法氏囊重量之和与鸡活体重的比。玫瑰花环试验方法采用淋巴细胞悬液0.02 ml，加入1%红细胞悬液0.02 ml轻震混合，37℃温箱或水浴保温5 min，低速离心（500 r/min）5 min，在4℃放置1～2 h，推片，自然干燥，美兰染色后分析。

2 结果与分析

2.1 给药结束后第0 d各指标的动态变化

给药结束后第0 d，复方制剂1组SOD活性显著高于对照组和其它各组（P＜0.05），MDA含量显著低于对照组和其它各组（P＜0.05），玫瑰花换率显著高于空白及攻毒对照组（P＜0.05）；复方制剂1、2组端粒酶活性均显著低于攻毒对照组（P＜0.05），复方制剂3组端粒酶活性显著高于其它各组；三种不同复方制剂组的免疫器官指数比均显著低于攻毒对照组、空白对照组（P＜0.05）；玫瑰花环率变化不明显，淋巴细胞转化率值均高于空白对照组，但无统计学意义。

综合分析表明，给药结束后第0 d，复方制剂1饲料添加饲喂MDV感染鸡，能增强机体的抗氧化能力和提高机体的免疫机能，在一定程度上降低MDV对机体的损伤程度（见图1、图2）。

图1 给药结束后第0 d组间各指标比较结果

图2 给药结束后第14 d组间各指标比较结果

2.2 给药结束后第14 d各指标的动态变化

给药结束后第14 d，各复方制剂组SOD活性显著低于攻毒对照组和空白对照组（P＜0.05），复方制剂1组的SOD活性显著高于其它两种复方制剂组（P＜0.05）；MDA含量显著低于其它两种复方制剂组；复方制剂2、3组MDA含量显著高于攻毒对照组（P＜0.05），复方制剂1、2组端粒酶活性显著低于攻毒对照组（P＜0.05）；三种不同复方制剂组的免疫器官指数比均低于攻毒对照组、空白对照组；三种不同复方制剂组T淋巴细胞转化率值均高于空白对照组；复方制剂1、2组T淋巴细胞转化率值低于攻毒对照组，但无统计学意义。

综合分析表明，给药结束后第14 d，复方制剂1饲料添加饲喂MDV感染鸡，在停药14 d后，肿瘤标志物端粒酶的活性显著降低，但是SOD活性与空白对照组相比，也同时降低，MDA含量也有所降低，免疫功能无明显改善，说明药效维持可能具有一定的时效性（见图1、图2）。

2.3 给药结束后第28 d各指标的动态变化

给药结束后第28 d，三种不同复方制剂组SOD活性显著低于攻毒对照组和空白对照组（P＜0.05），复方制剂1组的SOD活性显著高于其它两种复方制剂组（P＜0.05）；三种不同复方制剂组MDA含量显著高于攻毒对照组和空白对照组（P＜0.05），复方制剂1、2组端粒酶活性显著低于攻毒对照组（P＜0.05），高于空白对照组，复方制剂3组端粒酶活性显著高于攻毒对照组（P＜0.05）。三种不同复方制剂组的免疫器官指数比均显著低于攻毒对照组、空白对照组（P＜0.05）；复方制剂1组T淋巴细胞转化率值高于攻毒对照组、空白对照组及复方制剂2、3组，但无统计学意义（见图1、图2）。

综合分析表明，复方制剂1在给药期间，在一定程度上能提高机体的抗氧化能力、提高机体免疫力和降低肿瘤标志物端粒酶的活性，在抗肿瘤生成和抗病毒感染方面起一定的作用，但药效的维持有一定的时效性。

3 讨论

利用我国的医药国宝“中草药”进行抗肿瘤和抗病毒的研究已经进入了一个成熟阶段[14-17]，对其机理的研究也成为了热点。王三龙[18]等认为中草药在抗癌、防癌的方面有着巨大的潜能和美好的前景。厉将斌[19]等对复方921粗提物的研究中，发现其对肿瘤细胞的DNA合成有抑制作用，能诱导s期相关蛋白CycIinA表达下调。

机体的免疫系统具有限制肿瘤细胞生长的能力[20]。免疫系统能识别和杀死恶性肿瘤细胞，若免疫防护能力差或对不正常细胞识别能力差，会导致癌症发生率的升高，因此免疫刺激剂和免疫调节剂被认为是潜在的抗癌剂[20]。因此具有抗癌、提高机体免疫力功能的中药及其复方制剂成为新的研究热点。

永生性的获得是恶性肿瘤细胞的一个显著生物学特性，也是肿瘤组织具有无限增殖能力的基础，而肿瘤细胞无限增殖能力的维持则依赖于端粒酶的激活[21]。本研究在MDV感染鸡不同时期，对血液和组织样本进行了血液生化指标、病理学变化、免疫指标、机体抗氧化能力、端粒酶活性等的检测分析。通过分析发现三种复方都能在一定程度上增强机体抗氧化能力以及清除体内自由基的能力，降低细胞的损伤，提高免疫系统机能，同时抑制端粒酶活性，达到抑制细胞的永生化和抗肿瘤和抗病毒效果，但饲喂时间和效果之间的关系的研究，还有待深入。

利用中草药添加剂抗病毒，其药物处理简单，成本低，无药物残留，降低对人体的间接危害，在畜牧生产中具有良好的应用前景，但根据验方开发中药添加剂，对其有效的针对性应用以及使用方式还有待深入探讨。

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