评价纳米颗粒细胞毒性的方法

李晓东,徐 红

(吉林大学第一医院胃肠内科,吉林长春130021)

自20世纪80年代末以来,纳米科技迅猛发展,纳米材料在医学成像、疾病诊断、药物传输、癌症治疗、基因治疗等领域的应用越来越广泛[1]。但是,人们对于纳米材料对环境安全和人体健康所潜在的影响却知之甚少[2]。为此,纳米毒理学应运而生[3]。纳米毒理学是专门研究纳米颗粒或材料毒性的学科,运用一系列方法来分析纳米材料在体内和体外所产生的影响[4]。一般利用体外细胞毒性实验来进行纳米材料的细胞毒性评价,它是一类在离体状态下模拟生物体生长环境,检测医疗器械和生物材料在接触机体组织后所产生的生物学反应的体外实验[5]。纳米颗粒与细胞的相互作用研究刚刚开始[6]。细胞成活力评价包括增殖、坏死、凋亡等方面。本文就纳米毒理学中常用的细胞毒性检测方法作一简要综述,以供大家对纳米材料的细胞毒性进行评价时作为参考。

1 增殖检测

1.1 MTT法

MTT法即四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法。MTT比色分析法由Mosmann在1983年首创,其基本原理是活细胞内的线粒体脱氢酶能将染料MTT转变为不溶于水的蓝紫色结晶体甲瓒(formazan)颗粒,后者的生成量与活细胞数目和/或细胞活性呈正相关[7]。用二甲亚砜溶解所生成的甲瓒,然后通过酶标仪可以测定570 nm波长附近的吸光度。细胞增殖越多越快,则吸光度越高;细胞毒性越大,则吸光度越低。MTT法被广泛用于评价多种纳米材料的体外细胞毒性[8,9]。与其他毒性分析方法相比,MTT法有很多优点,例如:简单、经济、快速、灵敏,无放射性污染,不需预标记靶细胞[10]。缺点:需分别加入MTT及DMSO;测试后细胞不能继续培养;生成的甲瓒不易充分溶解。

1.2 WST-1法

WST-1是由日本同仁化学研究所开发的第一个水溶性四唑盐试剂,可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色甲瓒(formazan)颗粒,生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。WST-1是MTT的一种升级替代产品,和MTT或其它MTT类似产品如XTT等相比有明显的优点。第一,WST-1产生的甲瓒颗粒是水溶性的,不需要特定的溶解液来溶解。第二,WST-1更加稳定。第三,WST-1线性范围更宽,灵敏度更高。近年又出现了一种CCK-8试剂,其原理与WST-1法相同,也具有WST-1法的优点。侯春梅等[11]研究证明,CCK-8法显色时间短、操作简便、灵敏度高、重复性好,而且检测后的细胞可重复利用,具有一定的实用性,可以替代MTT法并广泛应用。

1.3 [3H]胸腺嘧啶掺入法

测定掺入新合成的DNA中的[3H]胸腺嘧啶的量,是一种敏感度非常高的检测细胞增殖的方法。原理是将放射性同位素3H代替H,根据细胞核酸代谢率不同,3H掺入的量也就不同,再用闪烁仪器定量检测不同样品中掺入的3H量,来反应细胞的增殖状态。如果[3H]胸腺嘧啶掺入量减少,说明细胞增殖受到抑制。但是这种方法经常不被采用,因为费用较高,而且需要接触3H同位素,对体外的细胞有损伤[12,13]。

1.4 Alamar Blue法

新一代荧光染料Alamar Blue为活细胞代谢指示剂,易溶于水。该法的原理为氧化型Alamar Blue可被活细胞中的线粒体酶还原,还原后染料发生颜色和荧光改变,其深浅与活细胞数量成正比,可用分光光度计或荧光检测仪检测[14]。该方法已被用于检测:多种化学物质的细胞毒性试验;淋巴细胞、贴壁或不贴壁的人及动物细胞株、细菌及真菌的增殖;细胞凋亡的量化以及细胞介导的细胞毒性试验等。杨阳等[15]研究发现 Alamar Blue法是一种简便、敏感、安全、经济的方法,可用于体外测定细胞增殖及化疗或免疫制剂的细胞毒作用。

2 坏死检测

细胞坏死是因病理而产生的被动死亡,往往会导致细胞膜破裂。在体外纳米毒理学实验中,细胞膜的完整性是一个可以用来评价细胞活力的指标[16,17]。常用的评价细胞膜完整性的方法包括:(1)检测细胞对某些离体活体染料的吸收,例如,台盼蓝(Trypan Blue)[18],中性红(Neutral Red)[19],碘化丙啶(propidium iodide)[20]等。(2)检测细胞死亡后渗漏到细胞培养基中的活性酶的量,主要是乳酸脱氢酶LDH分析法[21]。

2.1 染色法

台盼蓝和碘化丙啶是带电荷的分子,不能进入活的细胞。当细胞膜出现破裂时,台盼蓝就会进入细胞中,并且在605 nm波长处有较强的吸收。碘化丙啶进入细胞以后,会嵌入DNA和双链RNA中,用617 nm波长激发会发出荧光。中性红易溶于水和醇,水溶液呈红色,醇溶液为黄色。在生理条件的pH值时,中性红是不带电荷的,此时,中性红既能进入活细胞,也能进入死细胞。在活细胞中,溶酶体的酸度较高(pH≈4.8),中性红会被质子化并聚集于溶酶体中,在540 nm波长处有较强的吸收。因此,中性红可使活细胞染成红色,而死细胞不变色,这点和台盼蓝相反。以上这些检测技术可重复性好,并且应用流式细胞仪可提高检测速度。

2.2 乳酸脱氢酶LDH法

乳酸脱氢酶(LDH)是一种糖酵解酶,定位于细胞胞浆内。一般情况下,LDH不能透过细胞膜,当细胞受损伤或死亡时可释放到细胞外,此时培养液中LDH活性与细胞死亡数目成正比。乳酸脱氢酶能催化乳酸生成丙酮酸,丙酮酸与2,4-二硝基苯肼反应生成丙酮酸二硝基苯腙,在碱性溶液中呈棕红色,可通过比色求出酶活力。通过检测细胞培养液上清中的LDH的活性,可判断细胞受损的程度。优点:测定迅速,避免了同位素的使用,并且能够进行定量分析。缺点:(1)乳酸脱氢酶是大分子,只有靶细胞膜完全被破坏后才能释放出来,不能较早的反映细胞的存活状况。(2)影响因素较多,例如,培养基、测定环境的温度、pH、反应时间等[22]。

3 凋亡检测

细胞凋亡(apoptosis),又称程序性细胞死亡,是指细胞在一定的生理或病理条件下,遵循自身的程序,自己结束生命的过程[23]。细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞死亡形式。在2.2中介绍的方法只能检测坏死的细胞或者处于凋亡晚期的细胞,只有结合凋亡检测技术才能完整地揭示出细胞死亡的整个过程。凋亡检测技术被广泛地应用于纳米毒理学研究中,包括:细胞形态学变化,膜联蛋白V(annexin-V)法[24],DNA阶梯法(DNA laddering)[25],彗星实验(the Comet assay)[26],TUNEL法[27,28]等。

3.1 形态学观察

普通光学显微镜下可观察到贴壁生长的凋亡细胞皱缩、圆化,细胞的体积变小,但细胞膜完整,常可见胞膜发泡的现象,细胞凋亡晚期可见凋亡小体。在荧光显微镜下,吖啶橙染色后,活细胞核染色质呈现均匀分布的黄绿色荧光,胞质呈橘红色荧光,而凋亡细胞核染色质的黄绿色荧光浓聚在核膜内侧。透射电镜下可观察到细胞凋亡时特征性的超微结构改变,如凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩,表面微绒毛消失,核染色质凝聚、边缘化,呈新月形。

3.2 膜联蛋白V法

膜联蛋白Ⅴ(AnnexinⅤ)是一种相对分子质量为35-36 kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)高亲和力特异性结合。PS正常位于细胞膜的内侧,但在细胞凋亡的早期,PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜表面。因此,应用膜联蛋白Ⅴ法可鉴定早期细胞凋亡。将膜联蛋白Ⅴ用荧光素(FITC,PE,EGFP)标记,以标记了的膜联蛋白Ⅴ作为荧光探针,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

3.3 DNA阶梯法

细胞凋亡或坏死时,核内DNA都会发生断裂。区别在于,凋亡细胞DNA断裂点有规律地发生在核小体之间,出现长度为180-200 bp的DNA片段,电泳时呈现阶梯状条带;而坏死细胞的DNA断裂点无规律性,产生的杂乱片段在电泳时呈现模糊的连续性条带。利用这一特征可以将凋亡细胞与坏死细胞相区别。优点:简便易行,费用低廉。缺点:易受机械损伤、化学物质刺激等其他因素影响,而且只能定性,不能定量。

3.4 彗星实验

“彗星”电泳技术,即单细胞凝胶电泳(Single-cell gel electrophoresis,SCGE),可用于观察单个细胞DNA的损伤。此法是将少量分散悬浮的单个细胞与1%低温琼脂糖液混合后在冰冻玻片上制成琼脂板,细胞经过水解和碱化处理后,在较高pH值的环境下进行电泳。当DNA有断裂损伤时,细胞核中带有阴性电荷的DNA断片就从核心向阳极方向移动,形成一个类似“彗星”的图象,根据“彗星”的头部和尾部的大小和比率,从而确定细胞DNA损伤的程度。马爱国等[29]研究证明,“彗星”电泳技术是较敏感的DNA断裂损伤分析技术,在检测体内和体外细胞DNA的轻微损伤方面有着广泛的应用前景。

3.5 TUNEL法

TUNEL法,即脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminaldeoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nickend-labeling,TUNEL),其原理是:细胞凋亡时,染色质DNA断裂产生大量的粘性3′-OH端,在脱氧核糖核苷酸末端转移酶的作用下,将脱氧核糖核苷酸与荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到 DNA的3′-OH端,可通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。该法将分子生物学与形态学相结合,能准确地反应细胞凋亡时典型的生物化学和形态学特征,可检测出极少量的凋亡细胞,因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。

4 结语

纳米技术是柄双刃剑,纳米材料可能给人们的健康带来潜在危害。目前,纳米材料的毒理学研究还很不完善,人们对纳米材料毒性的认识也很贫乏。纳米毒理学研究与纳米技术发展是相互促进的,必须一起协调发展,才能更好地完成科学技术造福于人类的目的和任务[30]。对纳米材料毒性的研究,会促使人们重新设计、制造毒性较少的纳米颗粒,从而最终使纳米科技成为安全造福人类的新技术。

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