恶性肿瘤患者循环DNA的研究进展

倪培民,孙 然,王 雷,刘 铁,丛宪玲*

(1.吉林大学药学院,吉林长春130021;2.吉林大学中日联谊医院组织标本库)

*通讯作者

目前,对于恶性肿瘤,缺乏一种行之有效的早期诊断手段。绝大多数的恶性肿瘤明确诊断时已经是中晚期,经治疗后患者五年生存率极低[1],并且预后极易复发。所以建立一种方便、微创、灵敏、特异的恶性肿瘤早期诊断手段势在必行,循环DNA极易获得,在恶性肿瘤发生的早期其含量和基因的异常改变就可以被检测到[2],有望发展成为恶性肿瘤早期诊断的有效手段。

1 循环DNA的来源

循环DNA是一种存在于血浆或血清、脑脊液及滑膜液等体液中的细胞外DNA。肿瘤患者外周血中存在的循环DNA,含量明显高出健康人水平,并且这些循环DNA具有肿瘤特征性。定量或定性分析这些循环DNA对肿瘤的早期诊断、治疗及预后的评价都具有重要意义。

早在1947年Mandcl和Metals就发现了循环核酸,30年后Leon[3]等人的研究发现肿瘤患者血液循环中循环DNA的水平显著高于正常人。健康人外周血游离DNA大多来源于血细胞,而肿瘤患者的外周血游离DNA主要来源于肿瘤细胞。通过近年的研究,人们推测肿瘤患者循环血中存在着的大量DNA可能来源于以下一些途径[4]:(1)循环血或微转移灶中肿瘤细胞溶解;(2)肿瘤细胞的坏死或凋亡;(3)肿瘤细胞不断释放DNA进入血液循环;(4)肿瘤侵袭致周围细胞、组织变性而释放DNA入血;(5)淋巴细胞与肿瘤细胞的相互作用。由此可见,肿瘤患者循环DNA的形成是多种途径共同作用的结果。Domirguez等[5]分别检测同一组患者的血细胞、肿瘤组织和血浆中DNA变异,27例膀胱癌患者中17例检出血浆DNA与肿瘤组织DNA发生相同的改变。Szymanska等[6]检测的29例肝细胞癌患者血浆与肿瘤DNA变异一致性达88.5%,这些都说明了外周血循环DNA主要来自肿瘤细胞。

2 循环DNA的定量检测

有很多文献都有对DNA定量的研究,但是对于DNA的定量检测一直没有一个统一的标准,以前是加入一些显色剂,使之发生显色反应,然后根据颜色改变的程度与浓度的一一对应关系,检测其浓度,这种方法的特异性和敏感性非常低,限制了它们的应用。其它的分析方法,如血清凝集素抑制、补体结合等,在特异性上可能有所提高,但在敏感性上没有进一步的改善。近年来,随着DNA-RNA杂交技术、放射免疫分析法、对流免疫电泳技术的发展,纳克级(ng)的DNA可以被检测[7]。现在,实时定量PCR技术(Real-Time PCR)可以检测皮克(pg)级的DNA。当然也有一些改进技术或联合应用技术可以更加精确地测定循环DNA的含量。

赵文君[8]等对44例食管癌患者及100例健康对照的外周血,采用双重实时荧光定量PCR检测血浆DNA含量,结果发现食管癌患者血浆DNA含量显著高于健康对照(P＜0.001)。Ⅱa期、Ⅱb期和Ⅲ-Ⅳ期患者血浆DNA含量分别为37.0 ng/ml、53.0 ng/ml和66.3 ng/ml。 Ⅲ-Ⅳ期明显高于Ⅱa-Ⅱb期(P=0.003)。Ⅱa和Ⅱb期的血浆 DNA含量显著高于健康对照组(P＜0.001)。高、中分化组和低分化组的血浆DNA含量分别为 32.3 ng/ml、52.9 ng/ml和 65.0 ng/ml,低分化组显著高于高、中分化组(P=0.010)。潘世扬等[9]采用多重实时PCR技术对78例肺癌患者的血浆APC基因甲基化进行定量分析,其中的19例肺癌患者血浆中APC基因启动子甲基化阳性,APC甲基化浓度为1.67×102-6.78×103拷贝/mL,中位浓度为1.60×103拷贝/mL。38例组织阴性的肺癌患者、31例肺部良性疾病患者和23例健康者的血浆APC基因启动子甲基化均为阴性。

这表明在肿瘤患者中存在循环DNA水平的升高和甲基化异常现象,循环DNA可能成为肿瘤诊断的生物学标志,可能与肿瘤的临床分期和肿瘤分化程度存在相关性;实时定量PCR技术由于其高精度已成为现在检测循环DNA的主流技术。

3 循环DNA的定性分析

循环DNA和人类基因组DNA在核苷酸及碱基组成上是基本一致的,至少有47%的循环DNA碱基序列存在于人类基因组DNA中。已有很多研究表明循环DNA的基因改变与肿瘤组织DNA有较高的一致性[10-11]。目前循环DNA的定性分析包括:基因突变、甲基化异常、微卫星不稳定、杂合性缺失检测等。

3.1 循环DNA的基因突变

K-ras基因是p21蛋白质的编码基因,是人类肿瘤中最常见活化的原癌基因之一,在多种肿瘤中存在点突变,突变热点主要有三个,即密码子12、13、和61,尤其是12,这种异常尤以胰腺癌、结肠癌等发生率较高[12-13]。MuLcahy等[14]应用RFLP-PCR法检测了21例胰腺癌患者的循环DNA,结果有17例患者的循环DNA中有K-ras基因突变,其中有4例循环DNA中有K-ras基因突变的患者最初诊断为胰腺炎,在此后的5-14个月中相继被诊断为胰腺癌。

肿瘤抑制基因p53是迄今为止在人类癌症中最常突变的基因,且突变范围广,其功能缺失可导致细胞基因组不稳定并诱发肿瘤,也可阻断主要的凋亡途径。研究显示在结直肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌和头颈部癌患者血浆/血清DNA中检测到p53的点突变[15-16]。

3.2 循环DNA甲基化异常

DNA的甲基化是指生物体在 DNA甲基转移酶(DNA mothyltransferase,D MT)的催化下,以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体,将甲基转移到特定碱基上去的过程。DNA甲基化是人类重要的表观遗传学修饰,它可以调控基因的表达[19],由于甲基化的异常变化早于肿瘤的恶性增生[20],它的检测对肿瘤的早期诊断有重要意义。AnQ等[21]报道在所研究的105例非小细胞肺癌患者中,73.3%的血样中和79.3%的肿瘤样中,p16基因发生甲基化异常改变。Fujiwara K等[22]检测了91例肺癌患者血浆中的p16,MGMT、DAPK、RASSF1A和RAR-β基因,其中45例患者存在甲基化异常现象。Liu JY[23]等也检测了137例肺癌患者血浆中的p16基因,结果是105例患者存在甲基化现象,说明p16基因与肺癌的相关性比较高,对于肺癌的早期诊断有重要的意义。对于不同的恶性肿瘤,存在高甲基化现象的相关基因也不同,研究显示前列腺癌与 GSTP1基因[24-25]、肾癌与 VHL基因[26-27]、结直肠与MLH1基因[28]、食管癌与APC基因[29]相关性很高。建立各种恶性肿瘤的相关基因甲基化谱式对于肿瘤的早期诊断、预后判断及治疗都具有重要意义。

循环DNA的甲基化现象与肿瘤细胞DNA的甲基化现象呈现高度的一致性,并且甲基化异常现象先于肿瘤蛋白标志物的出现,对于恶性肿瘤的早期检测更有优势,有望成为评价肿瘤状态的特异性标志物。

3.3 微卫星改变

微卫星(microsatellite)序列,又称短串联重复(short tandem repeat,STR)序列,属于第二代DNA遗传标记,是由2-6个碱基对作为核心单位,串联重复排列而成的一类DNA序列,它在人类基因组中分布广泛且呈高度多态性。肿瘤中微卫星改变主要有两种:微卫星杂合性的缺失(Loss Of Heterozygosity,LOH)和微卫星不稳定性(Microsatellite Instability,MSI)。

3.3.1杂合性缺失(LOH)

LOH常表现为一条等位基因的突变及另一条等位基因的缺失,通过缺失使得杂合体中原先隐性突变的抑癌基因被显示出来,可以同时伴有基因两侧标志的缺失,使抑癌基因周围的区域成为纯合子或半合子,LOH可导致抑癌基因的失活,从而参与肿瘤的发生及发展。Allan等[17]对60例未确诊但怀疑有肺癌的病例进行研究,检测了47份支气管黏膜组织DNA和40份血浆DNA。结果发现,47份支气管黏膜组织中有13份检测出了LOH,而这13例患者都被证实患有肺癌,而40份血浆中有13份被检测出了LOH,这13例患者中有12例被证实患有肺癌,在血浆中检测出LOH的患者中63%也可在相应的组织内检测出LOH,而在肿瘤组织内检测出LOH的患者中有86%也可在血浆中检测出。说明了检测血浆中DNA的LOH可以作为早期诊断肺癌的一种手段。

3.3.2微卫星不稳定性(MSI)

MSI指在肿瘤发展的早期由于错配修复缺陷导致的DNA复制错误从而改变了微卫星序列的重复数目,出现滑动的插入及缺失,表现为基因组中简单重复序列次数的增加或减少,导致微卫星序列不能正常地发挥基因表达调控作用,进而使细胞增殖及分化异常,直接促进了恶性肿瘤形成和发展。Nunes等[18]用8个微卫星不稳定标志研究91例头颈部鳞癌患者的循环DNA,其中早期者17例,进展期者74例。结果有58例肿瘤组织发生微卫星不稳定性改变,并在17例(29%)患者循环DNA中检测到类似的改变,说明MSI的检测对于肿瘤的中早期检测具有一定的意义。

4 循环DNA的临床意义

健康人的外周血中只含有极少量的循环DNA,在炎症及肿瘤患者的外周血中循环DNA的含量明显增加。如果将检测外周血DNA水平应用于诊断恶性肿瘤,则必须先排除各类急慢性炎症和自身免疫性疾病。Leon[3]等很早就提出了监测外周血游离DNA水平在观察疗效、预测复发方面的作用,测定了173例不同恶性肿瘤患者治疗前外周血游离DNA的水平并观察其在放疗后的变化,结果表明,有转移的患者平均 DNA浓度为209±39 μ g/L,而无转移患者平均为 100±30 μ g/L,有显著差异。循环DNA水平与肿瘤患者的生存密切相关,手术前检测循环DNA水平可以初步判断肿瘤的侵袭转移潜能及预后,有助于对病人治疗方案的选择。循环DNA分子学改变对肿瘤的早期诊断及预后评估都有重要意义。

也有研究对循环DNA检测的意义提出不同的观点[30]。首先,循环DNA的起源没有一个明确的说法,认定循环DNA的确切来源还存在争议;再者,循环DNA水平是在一个宽量程、无序的范围内波动,检测的时效性是关键的因素;最后,由于对血样标本的处理不同、对照人群选择的差异和定量分析技术的差异,大量的同类研究之间存在显著性差异。

5 小结与展望

根据生物学的中心法则,遗传物质的改变是蛋白质构象和表达的改变的基础。因此,我们可以想象,每种肿瘤标志物的形成,其前提都存在着特定肿瘤DNA分子的缺失或突变。综上所述,检测外周血游离DNA对肿瘤的早期诊断、疗效监测及预后评价等都具有重要意义。笔者认为,尽管循环DNA的应用还有一些问题存在,但循环DNA的获得只需要患者的血清或血浆,较容易,可以发展成为一种方便、特异、无创的分子生物学检测手段,用于肿瘤的早期诊断和预防。另外,利用国内外建立的组织标本库等生物学资源,开展大规模的流行病学的监控,系统的收集癌症患者的血清标本,建立循环DNA定量检测的标准化程式以及各类型肿瘤定性分析的相关谱式,应作为未来研究的重点。唯有如此,循环DNA检测才能作为一种标准化的方法应用于临床。在未来的几年里,相信随着科学技术的发展,循环DNA检测技术的标准化,循环DNA在肿瘤的早期诊断和检测方面会得到广泛的应用。

[1]Keiichi Fujiwara,Nobukazu Fujimoto,Tabata M,et al.Identification of Epigenetic Aberrant Promoter Methylation in Serum DNA Is Useful for Early Detection of Lung Cancer[J].Clinical Cancer Research,2005,11:1219.

[2]Belinsky SA,Nikula KJ,Palmisano WA,et al.Aberrant methylation of p16INK4a is an early event in lung cancer and a potential biomarker for early diagnosis[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1998,95:11891.

[3]Leon SA.Shapino B.Skaaroff DM et al.Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy[J].Cancer Res.1977,37(3):646.

[4]张 忠,袁 媛.循环DNA、循环肿瘤细胞端粒酶与肿瘤早期诊断[J].癌症,2004,23(2):227.

[5]Dominguez G,Carballido J,Silva J,et al.P14ARF promoter hypermethylation in plasma DNA as an indicator of disease recurrencein bladder cancer patients[J].Clin Cancer Res,2002,8(4):980.

[6]Szymanska K,Lesi OA,Kirk GD,et al.Ser-249Tp53 mutationin tumour and plasma DNA of hepatocellularcarcinoma patientsfrom a high incidence area in the Gambia,West Africa[J].Int JCancer,2004,110(3):374.

[7]Ashutosh K.Pathak,Manisha Bhutani,Sachin Kumar,et al.Circulating Cell-Free DNA in Plasma/Serum ofLung Cancer Patients as a Potential Screening andPrognostic Tool[J].Clinical Chemistry,2006,52(10):1833.

[8]赵文君,潘世扬,马建锋,等.食管癌患者血浆循环 DNA定量检测及临床特征分析[J].临床检验杂志,2009,27(3):201.

[9]Shi-Yang Pan,Er-Fu xie,Yong-Qian Shu,et al.Methylation quantification of adenomatous polyposis coli(APC)gene promoterin plasma of lung cancer patients[J].Chinese Journal of Cancer,2009,28(4):1.

[10]Sozzi G,Musso K,Ratcliffe C,et al.Detection of microsatellite alterations in plasma DNA of non-small cell lung cancer patients:a prospect for early diagnosis[J].Clin Cancer Res,1999,5:2689.

[11]Sanchez-Ces pedesM,Esteller M,Wu L,et al.Gene promoter hypermethylation in tumors and serum of head and neck cancer patients[J].Cancer Res,2000,60(4):892.

[12]Mulcahy HE,Lyautey J,Lederry C,et al.A prospective study of K-ras mutationsin the plasma of pancreatic cancer patients[J].Clin Cancer Res,1998,4:271.

[13]Ito S,HibiK,Nakayame H,et al.Detection of tumor DNA in serum of colorectal cancer patients.Jpn J Cancer Res,2002,93(11):1266.

[14]Mulcahy HE,Lyautey J,Lederrey C,et al.A Prospective study of K-ras gene mutation in the plasma of pancreatic cancer patients[J].Clin Cancer Res,1998,4(2):271.

[15]Silva JM,Caroia JM,Dominguez G,et al.Persistence of tumor DNA in plasma of breast cancer patients after mastectomy[J].Ann Surg Oncol,2002,9(1):71.

[16]Huang XH,Sun LH,Lu DD,et al.Codon 249 mutation in exon of p53 gene in plasma DNA:maybe a new early diagnostic marker of hepatocellular carcinoma in Qidong risk area,China[J].World J Gastroenterol,2003,9(4):692.

[17]Allan JM,Hardie LJ,Briggs JA,et al.Genetic alterations in bronchial mucosa and plasma DNA from individuals at high risk of lung cancer[J].Int J Cancer,2001,91(3):359.

[18]Nunes DN,Kowalaski LP,Simpson AJ.Circulating tumor-derived DNA may permit the early diagnosis of head and neck squamous cell carcinomas[J].Int J Cancer,2001,92(2):214.

[19]Dahl C,Guldberg P.DNA methylation analysis techniques[J].Biogerontology,2003,4(4):233.

[20]Nuovo G J,Plaia T W,Belinsky S A,et al.In situ detection of the hypermethylation-induced inactivation of the p16 gene as an early event in oncogenesis[J].Proc Natl Acad Sci USA,1999,96:12754.

[21]AnQ,Liu Y,Gao Y,et al.Detection of p16 hypermethylation in circulating plasma DNA of non-small cell lung cancer patients[J].Cancer Lett,2002,188(1-2):109.

[22]Fujiwara K,Fujimoto N,Tabata M,et al.Identification of epigenetic aberrant methylationin serum DNA is useful forearly detection of lung cancer[J].Clin Cancer Res,2005,11:1219.

[23]Liu JY,An Q,XuGD,et al.Detection of hyper methylationof p16 gene in plasma DNA from lung cancer patients[J].Zhonghua Zhong Liu Za Zhi,2004,26:154.

[24]Lee WH,Isaacs WB,Bova GS,et al.CG island methylation changes near the GSTP1 gene in prostatic carcinoma cells detected using the polymerase chain reaction:a new prostate cancer bio-marker[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,1997,6:443.

[25]Herman JG,Latif F,Weng Y,et al.Silencing of the VHL tumor-suppressor gene by DNA methylation in renal carcinoma[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1994,91:9700.

[26]Battagli C,Uzzo RG,Dulaimi E,et al.Promoter hyper-methylation of tumorsuppressor genes in urine from kidney cancer patients[J].Cancer Res,2003,63:8695.

[27]Ricciardiello L,Goel A,Mantovani V,et al.Frequent loss of hMLH1 by promoter hypermethylation leads to microsatellite instability in adenomatous polyps of patients with a single?rst-degree member affected by colon cancer[J].Cancer Res,2003,63:787.

[28]Kawakami K,Brabender J,Lord RV,et al.Hypermethyl-ated APC DNA in plasma and prognosis of patients with esopha-geal adenocarcinoma[J].J Natl Cancer Inst,2000,92:1805.

[29]Sathyanarayana UG,Maruyama R,Padar A,et al.Molecu-lar detection of noninvasive and invasive bladder tumor tissues and exfoliated cells by aberrant promoter methylation of laminin-5 encoding genes[J].Cancer Res,2004,64:1425.

[30]Teare MD,Woll PJ.et al.Genomic tests:unreliable for cancer?A focus on circulating DNA and lung cancer[J].Expert Rev Mol Diagn,2007,7(6):699.