高迁移率族蛋白B1检测及其临床应用

李 蕾,杨 岚,陈国千*

(1.南京医科大学附属无锡人民医院医学检验科,江苏无锡214023;2.南京医科大学附属无锡妇幼保健院检验科)

高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)为细胞核中一种典型的非组蛋白,于20世纪70年代在胸腺中与染色体DNA一起纯化而被发现,因其在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的高迁移性而得名。HMGB1曾称为HMG-1、amphoterin,早期集中研究其核内功能,包括参与核小体的构建和稳定、调节基因的转录、参与DNA的重组修复和复制等。1999年,Wang等[1]发现HMGB1可以释放到胞外并介导炎症反应,为一种重要的晚期炎症介质,随后胞外HMGB1的致炎作用引起国内外广泛重视,诸多研究表明胞外HMGB1在急慢性炎症性疾病如脓毒症、关节炎、肺炎、急性胰腺炎等的发病过程中起着重要作用。现就HMGB1的检测方法和临床应用进展作一综述。

1 胞外HMGB1的致炎作用

HMGB1广泛分布于淋巴组织、脑、肝、肺、心、脾、肾等组织细胞中,主要存在于胞核,分子量约30 kDa。研究[2,3]显示巨噬细胞、单核细胞、垂体细胞、上皮细胞、肝细胞等受内毒素脂多糖(LPS)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、干扰素γ(IFN-γ)、生物活性脂等诱导后,HMGB1可主动分泌到细胞外。HMGB1因缺乏引导肽结构而不能以高尔基体/内质网途径分泌,可能通过非经典途径(如分泌溶酶体)释放。HMGB1胞外释放涉及胞核内HMGB1转移到胞浆然后胞外的过程[4]。坏死或受损细胞也可被动释放HMGB1,但凋亡细胞由于HMGB1紧密结合于染色质而不能释放HMGB1。胞外HMGB1与相应胞膜受体如晚期糖基化终末产物受体(RAGE)、Toll样受体2(TLR2)、Toll样受体 4(TLR4)等结合,通过胞内信号转导而发挥其生物学效应[2]。

近年诸多研究[2]证实,胞外HMGB1为一种重要的炎症介质和致炎细胞因子。体外实验表明,重组HMGB1激活巨噬细胞、外周血单核细胞、内皮细胞、肝细胞等表达和释放TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、巨噬细胞炎症蛋白 -1α(MIP-1α)、MIP-1β、细胞间粘附分子-1(ICAM-1)、血管细胞粘附分子(VCAM-1)等炎症介质或致炎细胞因子,启动和维持炎症免疫反应或使炎症恶化。最近Qin等[5]报道 HMGB1通过MAPK p38磷酸化明显加强内毒素的致炎作用。体内实验也显示HMGB1的致炎作用,给予小鼠半数致死量(LD 50)内毒素后8小时,血清HMGB1浓度升高,16-32小时后血清HMGB1水平达高峰,注射抗HMGB1抗体能有效抑制内毒素血症或脓毒症小鼠的炎症反应并降低死亡率[1];小鼠气管内给予HMGB1可诱发急性肺损伤,病变部位发生中性粒细胞聚集、水肿以及有早期致炎细胞因子如 IL-1β、TNF、MIP-2的产生,且呈剂量依赖效应[2];脑室内注射HMGB1后增加脑组织TNF、IL-6的表达,引发中枢神经系统的炎症反应;小鼠关节内注射HMGB1后可诱发关节炎。

2 HMGB1检测方法

目前,胞外HMGB1检测有蛋白免疫印迹(Western Blot)[1]、酶联免疫吸附试验(ELISA)[6,7]和凝胶阻滞分析(EMSA)[8]三种方法。蛋白免疫印迹分析是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测,操作繁琐费时,灵敏度低,准确性差,属于定性或半定量检测。

近年,Yamada等[6]使用抗HMGB1单克隆抗体建立了双抗体夹心ELISA法检测HMGB1,灵敏度、准确性、特异性明显提高,与HMGB2无交叉反应,且操作方便,可成批检测。Yamada等[6]建立的ELISA方法以辣根过氧化物酶为标记酶,而底物有四甲基联苯胺(TMB)、PS-1和PS-atto,前者为比色分析,后二者为发光分析;以PS-1为底物的 ELISA方法,有效检测范围为2-100 ng/ml,批间、批内变异系数分别为＜10%和＜5%,回收率为92-111%;而以四甲基联苯胺、PS-atto为底物的ELISA方法,灵敏度提高,检测线性范围分别为1-100 ng/ml和0.3-160 ng/ml。Urbonaviciute等[7]建立以生物素-亲和素系统为标记物和对硝基苯磷酸酯为底物的夹心ELISA法,检测线性范围达0.4-300 ng/ml,但Urbonaviciute等认为血清或血浆中存在抗HMGB1抗体和其它HMGB1结合蛋白,影响HMGB1的准确定量,应引起重视。为了进一步缩短检测时间,国内王维等使用抗HMGB1单克隆抗体以辣根过氧化物酶为标记酶(底物:邻苯二胺)建立了直接竞争ELISA法,测定范围为1-320 ng/ml,回收率为 97%-106%,变异系数为2.6%-7.3%。目前市场已有HMGB1的商品化ELISA试剂盒供应,日本Shino-Test公司供应的以四甲基联苯胺为底物的ELISA试剂盒,其批间、批内变异系数分别为＜8%和＜5%,血清或血浆标本回收率为80-120%,HMGB1最低检测浓度为＜1 ng/ml。

最近,Gaillard等[8]利用HMGB1蛋白与DNA片段探针呈高亲和力结合的特性,以同位素作探针标记,在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳,与HMGB1结合的DNA探针在凝胶中泳动速度慢,表现为相对滞后,以此原理建立凝胶阻滞分析(EMSA)。此方法对于成分复杂的标本如血清检测灵敏度达1 ng/ml,而对于成分不复杂的标本如细胞培养上清液则灵敏度更高,且不易受血清中的干扰蛋白影响。

由于HMGB1在血液、体液、细胞培养液、灌洗液等标本中一般含量较低,采用上述方法有时难以检出或准确定量,因此HMGB1测定方法有待进一步改进,以提高检测的灵敏度和准确性。另外,因细胞溶解可释放HMGB1,HMGB1检测的血液标本应立即分离血清或血浆。

3 HMGB1检测的临床应用

鉴于HMGB1在诸多疾病发病过程中的重要作用和HMGB1测定方法的改进,临床标本尤其血清中HMGB1检测的意义和应用日益受到重视。

诸多研究[1,9]显示脓毒症患者血清HMGB1水平明显升高,并发现血清HMGB1水平与血清C-反应蛋白、降钙素原、脂多糖结合蛋白、白细胞介素-6水平及白细胞计数等炎症指标间具有一定的相关性,但血清HMGB1水平与脓毒症严重程度及其预后的关系观点尚未一致。Zoelen等[10]报道腹膜炎所致脓毒症患者的腹水HMGB1水平为血浆HMGB1水平的10倍以上,肺炎所致脓毒症患者的支气管肺泡灌洗液HMGB1水平明显高于正常对照组,提示HMGB1释放可能主要发生在感染部位。

活动期类风湿关节炎患者血浆HMGB1水平显著高于健康对照组,并与红细胞沉降率、C-反应蛋白水平呈正相关,但风湿性关节炎患者血清或血浆中HMGB1水平未见升高[11]。

重症急性胰腺炎患者血清HMGB1水平明显升高,血清HMGB1水平与该病严重程度有关,并与乳酸脱氢酶、C-反应蛋白及总胆红素指标等呈显著性正相关。Lindstrom等[12]报道重症急性胰腺炎患者血清HMGB1水平与患者是否发展出现器官衰竭无关联。

社区获得性肺炎患者血清HMGB1水平升高,但与并发脓毒症无关。并发流感病毒感染的严重细菌性肺炎患者血浆HMGB1水平明显高于单纯细菌性肺炎患者,且前者血浆HMGB1水平与白细胞计数呈较好的相关性[13]。

慢性乙型肝炎患者血清HMGB1水平与病情的严重程度密切相关,HMGB1可能在慢性重型乙型肝炎患者肝衰竭的发生中起重要作用。HIV-1感染者血浆HMGB1水平明显升高,血浆HMGB1水平与性别、年龄、病毒量、CD4或 CD8 T-细胞数等无显著相关性[14]。

变应性肉芽肿性血管炎(亦称Churg-Strauss综合征)患者血清HMGB1水平明显高于哮喘患者和健康者,与血清可溶性IL-2受体、可溶性血栓调节素、嗜酸性细胞阳离子蛋白等水平呈显著性正相关,患者经激素治疗后血清HMGB1水平下降[15]。Yamada等[6]结果显示,随后发生心搏停止或急性心肌梗塞致死的急性冠脉综合症患者血清HMGB1水平明显高于未发生心脏意外者,如果以血清HMGB1水平0.6 ng/mL为界值,血清HMGB1水平用于预测急性冠脉综合症患者一个月内发生心脏意外的特异性和灵敏度分别为87%和71%。稳定型心绞痛和不稳定型心绞痛患者血清HMGB1水平与冠状动脉狭窄严重程度有关[16]。

血清HMGB1水平与组织缺血有关,失血性休克患者在休克后24小时内血清HMGB1水平升高,72小时达到峰值,96小时开始下降,而患者血压恢复和临床症状改善后,血清HMGB1水平也恢复正常。急性冠脉综合征和大脑缺血患者血清HMGB1水平明显升高[17]。弥散性血管内凝血使血浆HMGB1水平显著升高。缺血致血清HMGB1水平升高的机理还不清楚,可能是缺血后的TNF反应性升高激活免疫细胞释放HMGB1,或由损伤细胞或死亡细胞释放HMGB1。

机械外伤致血清HMGB1水平显著升高,外伤后1小时血清HMGB1水平升高30倍,2-6小时达峰值,并维持高值至136小时以上[18];外科术后患者血清HMGB1水平升高,并与术后并发症有关,术后血清HMGB1水平测定有助于术后并发症的监测[19];烧伤后患者血浆HMGB1水平明显升高。

脑膜炎患者脑脊液HMGB1水平升高,而细菌性脑膜炎患者脑脊液HMGB1水平为非细菌性脑膜炎患者的4倍,并与白细胞计数呈较好的正相关;蛛网膜下腔出血患者脑脊液HMGB1水平也明显升高,并与脑脊液中IL-6、IL-8及TNF-α水平呈显著性正相关[20]。风湿性关节炎患者关节滑液HMGB1水平升高,并明显高于骨关节炎患者。我们最近研究显示,胸水HMGB1水平检测对于胸腔漏出液与渗出液以及渗出液性质的鉴别诊断具有较好的临床意义,若结合胸水HMGB1/血清HMGB1比值分析,能进一步提高该指标的应用价值(待发表)。

胞外HMGB1作为一种重要的炎症介质已引起广泛重视,随着HMGB1定量检测方法如ELISA的建立,使之HMGB1检测的临床应用具有可行性。近年国内外很重视胞外HMGB1的临床研究,以了解胞外HMGB1在临床疾病发病机理中的作用,探讨胞外HMGB1测定在疾病风险预测、临床疾病诊断、预后判断中的意义,以及开辟临床疾病的HMGB1靶向治疗新途径。

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