缺氧诱导因子(HIF-1)的结构、调节与靶基因研究进展

邢英琦,徐 静,李 琳,江新梅

(吉林大学第一医院神经内科,吉林长春130021)

O2对于所有微生物的生存至关重要,是维持细胞内能量平衡的有氧代谢必不可少的物质。缺氧,是指O2水平低于正常的状态,可出现于各种生理情况(胚胎发育、适应高海拔、伤口的愈合)与病理情况下(缺血性疾病和癌症)。缺氧是一系列神经疾病(包括卒中、脊髓损伤和外伤性脑损伤)的中心因素,为了适应缺氧,微生物出现一系列系统性和局部性的改变以维持O2的平衡,减低缺氧的影响。系统性的改变是增加体内血流量以增加氧的运输;局部性改变主要是血管再生;在细胞水平,最显著的适应缺氧的反应是减少氧化磷酸化,增加糖酵解,以增加ATP的产量;在分子水平,主要的调节细胞对缺氧反应的调控者是缺氧诱导因子(HIF-1)。

1 HIF-1的结构

HIF-1是一种随着细胞内氧浓度变化而调节基因表达的转录激活因子,是一个异二聚体,由氧调节亚单位HIF-1α(120 kDa)和结构亚单位91-94kDa HIF-1β,也称作芳香烃受体核转运蛋白或ARNT)组成。HIF-1α和HIF-lβ均为基本螺旋-环-螺线(bHLH)转录因子家族中的成员,并具有Per-ARNTSim(PAS)结构域。PAS结构域含有50多个氨基酸重复序列,由His-X-X-Asp基本序列构成。bHLH和 PAS结构域介导DNA的结合能力并和二聚化作用有关。α亚单位上其他结构域包括一个独特的O2-依赖降解结构域(ODDD),这是正常氧分压下HIF-1降解所必须的结构;还包括两个反式激活结构域(transaction domain,TAD),主要参与转录激活作用;还包括N-末端活性域(NAD)和C-末端活性域(CAD)。

2 HIF-1的调节

在体内HIF-1的活性调节主要有4个方面,即HIF-1 mRNA的表达水平调节;HIF-1蛋白水平的调节;HIF-1二聚化和DNA结合活性的调节;HIF-1转录活性的调节。铁离子螯合剂、钴、镍等金属及部分抗氧化剂均能使HIF-1表达增加,但低氧是最主要的生理性HIF-1表达调节因子。

在正常氧浓度条件下,细胞内HIF-1α不稳定,半衰期不到5分钟,很快通过氧依赖降解结构域介导的泛素蛋白酶体降解。在低氧情况下,HIF-1α稳定性增加,转移到细胞核,与HIF-1β亚单位结合成二聚体HIF-1,HIF-1再与目的基因缺氧反应元件(HRG)结合从而激活转录过程。受HIF-1α调控的基因称为HIF-1α的靶基因,这些靶基因的启动子或增强子内含有一个或多个缺氧反应元件(HRE),其典型的核苷酸序列为5’-TACGTG-3’,是HIF-1的DNA 结合位点,活化的 HIF-1与之结合,形成HIF-1、p300/CBP环腺苷酸反应元件结合蛋白(CREB),以及其他转录因子的起始复合物,从而启动靶基因的转录[1]。

2.1 HIF-1α稳定的调节

①PHDs:HIF-α的量由氧依赖性和氧独立性机制调节。一方面,缺氧时α亚单位持续的转录和翻译,但是另一方面要求随时移走HIF-α。在有氧存在时,α亚单位被羟基化,之后迅速降解所以水平很低。激发羟基化作用的酶叫做HIF-脯氨酰4-羟化酶(PHDs)。PHDs包括 3个成员:PHD1、PHD2、PHD3,三者具有相近的催化域,属于2-丙戊二酸(2OG)依赖加氧酶家族。PHD1、2和 3 C-末端催化区相同,但是N-末端序列不同。PHD1与HIF-1α有最高的特异活性,主要在细胞核里,而PHD2和PHD3主要在细胞浆里。为了保持活性,这些酶要求有氧和2OG作为共同反应物,Fe2+和抗坏血酸作为辅因子[2,3]。PHDs羟基化人类HIF-1α分子的脯氨酸亚基(pro-564或pro-402),之后羟基化的HIF-1α可以结合到Von Hippel-Lindau蛋白(pVHL)-E3泛素连接酶复合物上。PHDs是调节HIF-α的关键酶。

②pVHL:羟基化的脯氨酸亚基能使HIF-1被pVHL特异的识别[4,5]。VHL蛋白,与延伸因子B、延伸因子C、Cul2形成E3泛素连接酶的复合体,主要在细胞水平调节HIF-1α[6]。VHL是一个肿瘤抑制基因,本身没有催化活性。然而它在HIF系统的调节及抑制肿瘤进展方面扮演重要的角色。pVHL有两个亚结构域,α和β,分别与延伸因子 C及HIF-α结合[7]。染色体中间缺失分析表明pVHL与HIF-1α氧依赖降解域(ODD)相互作用[7-10]。

③泛素连接酶和蛋白酶体:羟基化的HIF-1α与pVHL结合,继之泛素化。E2泛素连接酶UbcH5需要 K532、K538和K547受体以使VHL-介导的HIF-1α泛素化。之后,泛素化的HIF-1α转移位置,在26S蛋白酶体内降解[6]。

④转录后修饰:除了羟基化,其他转录后修饰也影响HIF-1α的稳定性。HIF-1α转移到核内后的调整(主要是磷酸化)有助于HIF-1的稳定和转录活性。最近研究发现,在缺氧时诱导一种蛋白名为“含有RWD sumoylation增强子”,增强低氧时HIF-1α的SUMO蛋白质修饰化,促进其稳定和转录活性[11]。

2.2 HIF-1α转录活性的调节

①FIH-1:为了实现其转录活性,HIF复合物需要结合到靶基因的HRE调节区。HIF-1α有两个活性域,协同起作用:位于中心区的NAD-与ODDD重叠,CAD-位于C-末端。CAD的功能主要依赖于转录共激活子CBP/p300,并且HIF-αCAD与CBP/p300相互作用的调节是控制HIF转录活性的第二个分子“开关”。正常氧供下,HIF-1阻滞因子(FIH-1)通过保守氨基酸序列YDCEVNV/AP上N803羟基化(HIF-2α的N847)结合到HIF-α的C末端,阻滞其与p300/CBP相互作用。门冬酰-羟化酶 FIH-1与 PHDs相似,也需要O2、Fe2+和 2OG 以保持活性。低氧时,阻滞了N803羟基化,允许CAD和CBP/p300上富有半胱氨酸/组氨酸区域1(CH1)相互作用。

②其他转录因子竞争性作用:除了通过门冬酰胺羟化控制能否与HIF-αCAD 结合,HIF-α CAD-CBP/p300相互作用可以被竞争性抑制。因为共激活子CBP/p300可与大量转录因子相互作用,他们结合的总量是有限的。比如CITED2(以前P35srj/Mrg1)以高亲和力与p300/CBP CH1结合,竞争性抑制其他p300/CBP CH1依赖转录因子,包括HIF[12]。活化的P53也能与p300/CBP螯合阻滞HIF功能[13]。

③共刺激子SRC-1与转录介导因子2:SRC-1与转录介导因子2进一步增强HIF-1α转活潜力,并与CBP/p300产生协同作用[14]。MAP激酶也调节HIF的转录活性,但是确切分子机制仍有争议。p42/44和p38MAP激酶均能刺激HIF-α活性,不影响其稳定[15]。

表1 HIF-1靶基因

3 HIF-α家族其他成员

除了HIF-1α,HIF-α家族包括另外两个成员,HIF-2α(也叫做内皮PAS区域蛋白-1,EPAS-1)和HIF-3α,后两者有更严格的组织表达。与HIF-1α相近,低氧时HIF-2α上调,并通过与缺氧反应元件(HRG)结合激活转录。HIF-1α、HIF-2α蛋白只有48%相同处,但是二者都含有保守的氧降解域,均被脯氨酰4-羟化酶调节。越来越多的证据表明HIF-1α、HIF-2α可能有不同的功能[16]。近期的分子遗传学研究证明HIF-2α是促红细胞生成素的生理性调节子,HIF-2α突变引起家族性红血球增多症[17]。HIF-3α在调节性氧降解域(ODD)上与HIF-1α、HIF-2α有高度相似性,但是缺少HIF-1α、HIF-2αC-末端转录激活域。低氧时HIF-3α活性被上调,它与 HIF-1β形成二聚体,并与HRE核心序列相结合,但是有趣的是,在人的肾脏,HIF-3α作用似乎是抑制缺氧诱导HIF介导的基因表达,因此HIF-3α是缺氧诱导基因表达的副调节因子[18]。

4 HIF-1靶基因

估计全部HIF靶基因200种-全部人类基因的1-5%,尽管并非全部直接由HREs调节,其它转录因子也参与其中。HIF激活的转录因子DEC1和2、ETS-1也可诱导缺氧基因表达。缺氧时,常见的应激反应转录因子,比如AP-1、NF-κ B和Egr1也上调,尽管这些因子对轻度缺氧的敏感性和转录反应的持久性远不如HIF-1。

目前已确认HIF途径直接激活超过70种基因,见表4.1。HIF诱导的蛋白表达主要帮助缺氧细胞的代谢和生存需要。功能包括血管再生、红血球生成、凋亡、细胞分化/生存、糖代谢、PH值调节和铁代谢。有趣的是,HIF激活的基因中即有编码前凋亡蛋白的基因NIP3、BNIP3、Noxa,又有编码抗凋亡蛋白的基因Mcl-1,这提示前凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的比值不同可能导致细胞对于缺氧有不同的反应。

结束语:HIF-1是一个重要的转录调控因子,在神经系统疾病中扮演重要的角色,因此对HIF-l结构、调控和靶基因的深入研究,必将为今后的临床治疗提供新的思路和方法。

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