早期脑损伤新生大鼠脑白质神经蛋白聚糖和多功能蛋白聚糖表达及意义

覃海茂, 姜志梅, 郭岚敏, 张虎

宫内感染是绒毛膜羊膜炎及胎膜早破的最主要原因,也是脑室周围白质软化(periventricular leukom alacia,PV L)和脑性瘫痪(cerebral palsy,CP)发生的主要原因之一。伴随炎症反应的神经胶质增生中存在几种化学介质,通过破裂的血脑屏障刺激了局部硫酸软骨素糖蛋白多糖(chond roitin sulfate proteoglycans,CSPGs)表达增多。神经蛋白聚糖(Neurocan)和多功能蛋白聚糖(Versican)是CSPGs的两个大亚类分子。本研究采用实时荧光定量RTPCR检测宫内感染致脑损伤新生大鼠脑白质区Neurocan和Versican在不同时间点的表达,探讨Neurocan和Versican在中枢神经损伤与修复、神经元相互作用和功能重组的机制,有助于中枢神经系统损伤后的康复治疗。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级成熟W istar雌性大鼠40只,雄性大鼠10只,体质量180～240 g,由佳木斯大学实验动物中心提供(黑动字第99102001)。

1.2 药品与试剂 Neurocan引物、Versican引物、溴乙锭(上海生物工程有限公司),Co lum n A nimal RNAOUT(北京天恩泽公司),PrimeScriptTMRT reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqTM II、Rnase 抑制剂(TAKARA公司),琼脂糖(美国Sigm a公司),Taq DNA聚合酶、100 bp M arker(宝生物工程(大连)有限公司)。

1.3 模型制作与分组 于17时以4∶1合笼,次日上午8时查阴道涂片,以查得精子为妊娠第0天,孕鼠另笼饲养。40只受孕母鼠随机分为对照组(n=10)和脂多糖组(n=30),给予受孕18 d的脂多糖组孕鼠脂多糖(血清型055)380μg/kg,连续2 d腹腔注射,对照组孕鼠腹腔注射同等剂量的生理盐水。观察两组孕鼠的分娩时间,去除早产鼠(孕22 d前分娩)。仔鼠出生后,取胎盘做苏木精-伊红(HE)染色观察宫内感染情况。

1.4 观察指标

1.4.1 HE染色观察新生大鼠脑白质病理学改变 大鼠脑白质经固定、脱水、石蜡包埋后,将蜡块行冠状切片(5μm)置于经APES防脱片剂处理的载玻片上,经脱蜡、HE染色、二甲苯透明,光镜观察病理改变。

1.4.2 荧光定量RT-PCR检测Neurocan m RNA和Versican mRNA Neurocan(77 bp)上游引物:5'-ACC TGG TAA CCC TGG AAG TGA-3'下游引物:5'-AGCGAA GGT CAA CGC ATA GC-3';Versican(90 bp)上游引物:5'-GCC ATC GAC AGC CTT CAC AG-3'下游引物:5'-CTC ACT GGG CTC CTTCTC AAA G-3';β-actin(150 bp)上游引物:5'-GGA GAT TAC TGC CCT GGC TCC TA-3',下游引物:5'-GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG CTG-3'。取500 ng cDNA依次梯度稀释1倍、10倍、102倍、103倍、104倍,分别作为模板按照以下反应体系和反应条件进行扩增,7300 PCR仪自动生成标准曲线,通过R2值检验标准曲线的可行性。每一个待测指标对应一条标准曲线,且标准曲线的模板来自同一管cDNA。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件,数据资料以 x±s表示,两样本均数比较采用t检验;对所有结果进行正态性及方差齐性检验后,进行方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 孕鼠分娩及仔鼠的一般情况 对照组孕鼠均顺利生产,孕鼠无死亡及提前分娩,共娩出活产足月仔鼠124只;脂多糖组中孕鼠5只死亡,6只提前分娩,剩余19只共娩出活产足月仔鼠132只,死亡24只。足月仔鼠出生后颜色淡红,体质量正常。早产仔鼠颜色青紫、精神萎靡、进食减少、行动迟缓、活动减少、体质量低。

2.2 仔鼠脑白质病理学改变 各时间点对照组脑白质区神经细胞形态正常,轮廓清晰,核仁核膜明显,大小无变化,未见明显损伤性改变。脂多糖组0 d可见脑白质区内细胞胞体肿胀、细胞稀疏、间隙增宽,1 d毛细血管扩张,神经细胞排列紊乱、结构不清,7 d出现少量神经细胞肿胀、数量略有减少,细胞皱缩,14 d可见明显的毛细血管扩张,脑室内出血,坏死灶中可见较多的胶质细胞,细胞核固缩、核碎裂明显,21 d可见神经细胞大多数坏死,周边有胶质细胞增生,28 d脑室旁白质呈筛网状坏死。

2.3 两组不同时间点Neurocan和Versican m RNA比较 脂多糖组0,1,7,14,21,28 d Neurocan m RNA相对表达量均较对照组高,差异有统计学意义(均P<0.05)。脂多糖组Neurocan m RNA相对表达在1 d升高显著,7 d达高峰,28 d仍高于对照组(P<0.05)。脂多糖组0,1,7,14,21,28 d Versican m RNA相对表达量均较对照组高,差异有统计学意义(P均<0.05)。脂多糖组Versican m RNA相对表达在7～14 d达高峰,21～28 d逐渐下降,但仍高于对照组(P<0.05),见表1。

表1 不同时间点两组Neurocan和Versican mRNA相对表达量比较( x±s,n=10)

表 1结果表明,两组 Neurocan和 Versican mRNA表达不同时间点间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。脂多糖组Neurocan mRNA表达0,1,14,21 d时间点比较差异有统计学意义(P<0.05);Versican mRNA表达0 d与1 d,1 d与7 d,14 d与21 d,21 d与28 d比较差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

大量的动物实验和临床资料均证明感染、炎症反应是导致脑白质损伤的重要因素。Dammann等[1]发现胎盘感染的新生儿发生PVL和脑室扩大的危险性增加60%～70%。此后,研究人员 Bell等[2]通过在受孕大鼠注射脂多糖建立的动物模型发现宫内感染能导致仔鼠脑白质损伤。外伤性脑损伤和高血压脑卒中也会引起脑白质发生改变,但这类损伤机制在时间和空间上与脑性瘫痪发病机制截然不同。本实验HE染色结果示脂多糖组0 d可见脑白质区内细胞胞体肿胀、细胞稀疏、间隙增宽;1 d脑白质区内毛细血管扩张,神经细胞排列紊乱、结构不清、核固缩变圆;7 d脑白质区内出现少量神经细胞肿胀、淡染,神经细胞的数量略有减少,细胞皱缩;14 d可见明显的毛细血管扩张,脑室内出血,坏死灶中可见较多的少突胶质细胞及小胶质细胞,细胞核固缩、碎裂明显;21 d可见部分细胞核浓缩、碎裂结构消失,神经细胞大多数坏死,嗜伊红深染,周边有胶质细胞增生;28 d脑室旁白质呈筛网状坏死。

Neurocan是神经组织中硫酸软骨素蛋白聚糖中一种重要物质,主要来源于神经胶质细胞。Neurocan与神经细胞黏附分子、细胞外基质和生长因子相互作用,参与细胞转移和细胞增殖。大量证据表明,从kainite诱发癫痫开始,外伤性病变、局灶性脑缺血性发作等各种中枢神经损伤后出现Neurocan重现和积累[3]。Versican也是CSPGs家族成员之一,主要来源于少突胶质细胞前体细胞。通过免疫组化发现,用单面刀缺损大脑皮质后7 d冻存标本Versican在损伤周围显著增加;采用Western blot分析比较损伤与未损伤组织,发现损伤组织中有大量Versican。人体中枢神经系统中Neurocan表达在胎儿期达到高峰,在儿童期有全段和部分片段的神经蛋白聚糖链,而在成年期只有部分片段的糖链。当成熟的中枢神经系统损伤后,又可有全长的糖链出现,由此可见,中枢神经系统(central nerve system,CNS)损伤后,损伤位点蛋白表达上调[4]。由于受到发育调节,Neurocan在胚胎发育晚期表达增多但在出生后1个月内出现显著下降[5]。也有研究认为,在正常CNS发育过程中,在出生时Neurocan表达达到最高[6]。本实验结果显示,对照组Neurocan表达在0 d达到最高水平,而脂多糖组Neurocan相对表达在1 d升高显著,14 d达高峰,28 d仍高于对照组(P<0.05)。脂多糖组Versican相对表达在7～14 d达高峰,21～28 d逐渐下降,但仍高于对照组(P<0.05)。其一,在成年哺乳动物中枢损伤部位及炎症反应区,组织损伤和血脑屏障破坏引起局部炎症细胞入侵和炎症因子的释放导致细胞外基质分子上调,胶质活化启动,从而使CSPGs长时间大量表达[7];而这些物质与细胞生物行为密切相关,影响细胞黏附,调节轴突生长,在中枢神经系统损伤后的修复过程中发挥着重要作用[8]。CSPGs具有调节细胞外基质和黏附分子以及细胞支架的组成,参与细胞与细胞基质信号传导和物质交流,与生长因子共同影响神经元和轴突的生长,以及通过神经元周围网络调整神经细胞的可塑性[9]。随着中枢神经系统发育成熟,可塑性也随着降低。可塑性的关键窗口期通常在生后早期。在发育早期阶段,CSPGs在神经元胞体及突触周围逐渐形成神经元周围网络,引起脑的可塑性机制停止[10]。其二,实验发现在局灶型PV L的早期,脑白质区可见一些炎症细胞聚集在坏死区的周围,其中大量出现双核特征的反应性胶质细胞;在 PVL后期,主要以脑室周围白质囊腔存在为特征,神经胶质增殖及纤维化形成胶质瘢痕组织[11]。其三,CSPGs既可以在脑损伤早期由一系列炎症因子和神经介质等刺激反应性胶质细胞表达,又可以在损伤后修复期存在于胶质瘢痕中。其四,正常发育的脑组织也存在CSPGs两个亚型,但中枢神经生长的微环境处于平衡状态,其表达会受到控制,不会阻碍神经元生长。因此,在中枢神经发育早期出现的一系列炎症和免疫反应将逐步激活大量反应性胶质细胞表达CSPGs,出现一个高峰;随后出现下降,可能与神经细胞损伤后凋亡坏死有关;之后维持在一定水平,可能由于损伤后修复形成胶质瘢痕所致。本实验通过脂多糖制备宫内感染模型,从不同时间点动态了解CSPGs表达变化,根据CSPGs表达情况间接说明CNS损伤的内在机制,为临床早期干预和治疗找到一个恰当的“时间窗”。

CNS损伤后,神经元及轴突再生失败主要由于神经再生抑制物质的存在。为了建立一个适合CNS生长的微环境,研究人员致力于从CSPGs降解药物和信号通路方面探讨新的途径。目前研究比较热门的几点如下:采用单剂量到多次注射或使用微泵给硫酸软骨素ABC降解CSPGs的抑制作用,促使损伤的神经元轴突生长[12];采用金属硫蛋白诱导星型胶质细胞,导致CSPGs表达下调,此过程是由JAK/STAT和Rho信号通路调控;并且也有人认为CSPGs表达上调,是由MAPK信号通路介导[13];研究发现CSPG的信号通路与Rho/ROCK通路有关,例如小鸡的背根神经节神经元含有神经蛋白聚糖底物,可以刺激 GTPase家族的 Rho/ROCK通路[14];除了 Rho-或ROCK-抑制剂,非甾体抗炎药如布洛芬、消炎痛,通过抑制RhoA促进轴突再生也能显示出类似的作用。动物实验将布洛芬注射到脊髓损伤区,发现非甾体抗炎药能阻止RhoA激活,刺激轴突生长[15]。此外,CSPGs还可以通过integrin信号通路调节多功能的神经母细胞生长、分化、转移[16]。

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