紫杉醇对鼻咽癌细胞放疗增敏作用的研究

杨永净,刘士新,刁建东

(1.吉林省肿瘤医院 放疗二科,吉林 长春 130012;2.吉林大学中日联谊医院 肿瘤血液科,吉林 长春 130033）

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma）是我国常见的恶性肿瘤之一,在头颈部恶性肿瘤中占首位。放射治疗是鼻咽癌的主要治疗手段,但鼻咽癌的放疗疗效受肿瘤细胞放射敏感性的限制。近年的研究表明,肿瘤细胞的放射敏感性与细胞在增殖周期各时相的分布密切相关,因此本研究选择具有细胞周期阻滞效应的紫杉醇与放射治疗联合应用,以探讨其对细胞放射敏感性的影响及其可能机制。

1 材料和方法

1.1 细胞株、药物和试剂人鼻咽癌CNE细胞株购自中国科学院上海细胞库。紫杉醇为山西普德公司产品。噻唑蓝(MTT）、二甲基亚砜(DMSO）购自Sigma公司,RPMI-1640、胰蛋白酶购自GIBCO公司,胎牛血清购自天津TBD公司。

1.2 细胞及培养条件人鼻咽癌细胞培养于含有10%胎牛血清的PRMI-1640培养基中,37℃,5%CO2条件下常规培养。

1.3 MTT法测定药物IC50及IC10值鼻咽癌细胞按5×103/孔的密度接种于96孔培养板,待贴壁生长至对数生长期时,加入稀释后的紫杉醇,使其终浓度依次为 10-5、10-6、10-7、10-8、10-9μ mol/ml。每一浓度设3复孔,并设正常对照孔及空白调零孔。置37℃培养箱孵育24 h后,弃去药物及陈旧培养基,每孔加新鲜配制的MTT(5 mg/ml）20 μ l再次孵育4 h,弃去MTT 液,每孔加DMSO 200 μ l,酶联免疫检测仪于490 nm波长测定吸光度(A490）。选择抑制率约为10%的药物浓度为亚细胞毒剂量浓度。肿瘤细胞抑制率=(对照组A值-实验组A值）/对照组A值×100%

1.4 MTT法检测紫杉醇对放疗的增敏作用将对数生长期的细胞随机分为四组:细胞对照组(不进行药物处理,给予等体积PBS）;单纯照射组(细胞以6 Gy剂量进行照射）;单纯紫杉醇用药组(细胞加入亚细胞毒剂量紫杉醇）;照射联合紫杉醇组(细胞加入亚细胞毒剂量紫杉醇后,以6 Gry剂量进行照射）。将培养的肿瘤细胞以5×103/孔的浓度接种于96孔培养板,按上所述对各组细胞分别进行处理,24 h后倒置显微镜观察细胞增殖抑制情况;同时MTT法检测各孔在490 nm处的光吸收值(A490）,按公式计算各组抑瘤率。

1.5 流式细胞分析同上将肿瘤细胞以5×103/孔的浓度接种于96孔培养板,按分组分别进行相应处理,24 h后胰酶消化,各组收集细胞2×106个。70%冰乙醇固定,PI染色后流式细胞仪分析细胞周期及凋亡情况。

2 结果

2.1 MTT法检测紫杉醇对放疗的增敏作用结果显示随着紫杉醇浓度的增加,细胞存活率降低,呈现明显剂量依赖性关系。本实验中选择浓度10-8 μ mol/ml为亚细胞毒剂量进行给药。

如前述对细胞分别进行单纯照射、单纯紫杉醇用药、照射联合紫杉醇用药处理,结果可见,与对照组相比,亚细胞毒剂量紫杉醇用药组细胞体外增殖活性抑制不明显,单纯照射组及照射联合紫杉醇组细胞抑制率均高于空白对照组,且照射联合紫杉醇组高于单独照射组。MTT检测,细胞抑制率分别为10.8%,30.4%和45.5%。鼻咽癌对放疗敏感,而紫杉醇可进一步增强肿瘤细胞对射线的敏感度。

2.2 不同处理对细胞周期和细胞凋亡的影响不同实验组细胞处理24 h后,进行流式细胞检测,结果显示单纯照射组、单纯紫杉醇用药组、照射联合紫杉醇组均出现不同程度凋亡,其中单纯照射组高于单纯紫杉醇用药组,照射联合紫杉醇组显著高于单纯照射组和单纯用药组。单纯照射6 Gy引起的阻滞以G2/M期为主;紫杉醇联合照射可进一步诱导G2/M期阻滞。

3 讨论

放射治疗为鼻咽癌的主要治疗手段,早期病人单纯放疗效果较好,但因其发生部位隐蔽,症状多样性,就诊病人70%为Ⅲ期、Ⅳa期的局部晚期病人,单纯放疗疗效较差,局部复发和远处转移为常见的失败原因。为提高局部晚期鼻咽癌的治疗效果,局部放疗和全身化疗相结合成为国内外研究的热点。临床试验结果显示以DDP和5-Fu为基础的诱导化疗提高了局部晚期头颈部癌放疗的效果,同时放化疗具有两种细胞毒作用同时叠加,缩短总疗程时间的优势,一些化疗药物还有放射增敏作用,试验结果显示其疗效优于序贯化放疗[1]。

紫杉醇(Tatol,paclitaxel）是近年来研究开发的化学结构新颖、作用机制独特的新型抗肿瘤药物[2]。它可促进微管双聚体装配成微管,并阻止微管蛋白解聚,使微管稳定,从而阻碍细胞分裂,使其发生凋亡,达到抑制肿瘤细胞的生长。该物在卵巢癌、非小细胞肺癌和乳腺癌治疗中显示了良好的疗效;在头颈部肿瘤中也具有很好的单药有效性[3,4]。近期研究表明紫杉醇对包括头颈部癌在内的一系列细胞系具有明显的放射增敏作用[5]。其独特的放射增敏机制表现为G2/M期细胞周期阻滞、诱导细胞凋亡和促进肿瘤细胞再氧合[6,7],而处于G2/M期细胞周期的肿瘤细胞对放疗敏感。

本研究结果显示照射联合紫杉醇组肿瘤抑制率显著提高,流式细胞检测紫杉醇则可将细胞周期阻滞于G2/M期,与文献报道相符。紫杉醇与放疗协同作用后,显著阻滞了细胞的总细胞周期进展,从而明显增强了抑制肿瘤细胞生长和诱导凋亡的作用,大大提高了肿瘤细胞对放疗的敏感性。实验研究结果表明紫杉醇与放疗联用,可显著提高肿瘤细胞的放射敏感性,而其对细胞周期的影响可能是提高细胞放射敏感性的机制之一。

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