雌呋栓微生物限度检查方法的建立

何培孝 王伟娜 杨利红

雌呋栓微生物限度检查方法的建立

何培孝 王伟娜 杨利红

目的建立雌呋栓的微生物限度检查方法。方法 按照《中国药典》2010年版附录的要求进行方法学验证，细菌、霉菌及酵母菌计数采用培养基稀释法，控制菌检查采用常规法。结果细菌、霉菌及酵母菌的菌回收率均大于70%，控制菌检查中，各阳性试验菌均检出，阴性对照无菌生长。结论该法可消除雌呋栓的抑菌作用，适用于该制剂的微生物限度检查。

雌呋栓;微生物限度检查;方法学验证

雌呋栓用于女性缺乏雌激素、子宫严重萎缩、慢性阴道炎及老年性阴道炎等疾病的治疗。为有效控制药品的质量，保证微生物限度检查方法的科学性和检验结果的准确性，笔者根据《中国药典》2010年版［1］附录微生物限度检查的新要求，对雌呋栓进行了微生物限度检查的方法学验证。

1 材料

1.1 培养基与试剂 pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基、沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基、溴化十六烷三甲基三甲铵琼脂培养基、无菌十四烷酸异丙酯。以上均由中国食品药品检定院提供。

1.2 菌种 金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26 003］、枯草芽孢杆菌［CMCC(B)63 501］、大肠埃希氏菌［CMCC(B)44 102］、铜绿假单胞菌［CMCC(B)10 104］、白色念珠菌［CMCC(F)98 001］、黑曲霉菌［CMCC(F)98 003］。以上均由中国食品药品检定院提供。

1.3 样品 雌呋栓，哈尔滨某医院提供(批号为20101228、20101229、20101230)。

2 方法与结果

2.1 菌液制备 取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的新鲜斜面培养物接种于营养肉汤培养基中，在30～35℃培养18～24 h;接种白色念珠菌的新鲜斜面培养物至改良马丁培养基中，在23～28℃培养24 h，分别取上述培养液用0.9%无菌氯化钠溶液10倍依次稀释至浓度约为50～100cfu/ml备用。取黑曲霉菌新鲜斜面培养物，加含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液［2］适量将孢子洗下，并用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至浓度约为50～100cfu/ml，备用。

2.2 供试液的制备 取本品10 g，加至含20 ml无菌十四烷酸异丙酯和无菌玻璃珠的适宜容器内，置40～45℃保温，充分振摇使溶解，加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100 ml，萃取5～10 min，静止，取水层作为1：10的供试液。

2.3 细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证

2.3.1 试验组 取1：10供试液1 ml，分别等量加入5个平皿中(每皿0.2 ml)，加入各试验菌1 ml，加入相应琼脂培养基，按规定条件培养，计细菌、霉菌及酵母菌数(n=3)。

2.3.2 菌液组 吸取上述稀释的阳性菌菌液各1 ml至平皿中，立即倾入相应的培养基，置规定条件培养，计各阳性菌的菌落数(n=3)

2.3.3 供试品对照组 测定样品本底的菌数，方法同试验组，不加阳性对照菌(n=3)。

2.3.4 稀释剂对照组 取试验用稀释剂代替供试液测定，方法同试验组(n=3)。

2.3.5 回收率结果 试验组菌回收率%=(试验组平均菌落数－供试品对照组平均菌落数)/菌液组平均菌落数×100%。稀释剂对照组菌回收率%=稀释剂对照组平均菌落数/菌液组平均菌落数×100%。平均回收率结果见表1。

表1 细菌、霉菌及酵母菌方法验证的平均回收率(%)

从表1可以看出，5株试验菌的试验组菌回收率与稀释剂对照组的菌回收率均大于70%，因此，可采用该法测定样品的细菌、霉菌及酵母菌数。

2.4 控制菌检查方法的验证

2.4.1 试验组 取2份1：10的供试液(每份10 ml)，分别接种至营养肉汤培养基、沙氏葡萄糖液体培养基各500 ml中，再分别加入阳性对照菌金黄色葡萄球菌和白色念珠菌菌液各1 ml，置规定条件培养;另取1：10的供试液10 ml，加胆盐乳糖培养基100 ml，再加入阳性对照菌铜绿假单胞菌液1 ml，置30 ～35℃培养 18～24 h。

2.4.2 阴性对照组 取等量稀释剂，方法同试验组(不加阳性对照菌液)。

2.4.3 验证结果 试验组检出阳性试验菌，阴性对照组无菌生长，见表2。

表2 控制菌检查方法学验证结果

从表2看出该控制菌检查方法适用于本品的检查。

3 讨论

3.1 雌呋栓为阴道用药，按《中国药典》2010年版附录微生物限度检查法要求，增加了对白色念珠菌的检查;

3.2 控制菌检查中取消了阴性对照菌(大肠埃希氏菌)试验，取而代之以测定所用稀释剂作为阴性对照组进行试验;

3.3 经方法学试验，雌呋栓具有一定抑制微生物生长的作用，采用稀释基稀释法(细菌、霉菌及酵母菌检查取五皿，每皿加样0.2 ml;控制菌检查培养基用量为500 ml)可有效去除样品中的抑菌作用，为临床用药提供质量保证。

［1］ 中国药典.二部，2010：107-116.

［2］ 李云龙.中国药品检验标准操作规范.北京：中国医药科技出版社，2010：400.

150001黑龙江省食品药品检验检测所