DNA分子力学性质的测量

冉诗勇，王艳伟，杨光参

（温州大学物理与电子信息工程学院物理实验中心，浙江温州325035）

1 引 言

生物学与物理学的相互交融自20世纪以来已是大势所趋.DNA作为生物学中最重要的大分子，同时受到了物理学家和生物学家的关注.生物学家更关注DNA作为遗传密码的生物学功能，而物理学家则将之看做受弹性理论和聚电解质理论支配的带负电的高分子.虽然各自关注的重点不一，但两者之间存在密切联系.DNA的力学性质直接影响到了其生物学功能，例如在DNA重组过程中，DNA必须被拉长到其正常的右螺旋态的大约1.5倍长.

20世纪90年代初发展起来的单分子生物物理研究则为生物学家和物理学家架设了一个很好的互通桥梁.这一领域通常利用单分子实验技术（如光镊、磁镊等）操纵单根DNA分子，探索如DNA力学性质，DNA与蛋白相互作用等双方都关注的科学问题[1－3].目前这一领域仍在蓬勃发展中，及时地向物理学背景的研究生以及本科生介绍这一领域显得尤为必要.

近年来，我们在近代物理实验教学中利用自行研制的单分子磁镊装置，以测量单根DNA的力学性质为基础实验内容，以观测DNA与各种作用因子作用为设计实验内容，开设了单分子生物物理综合设计型实验.这一实验既涉及到了生物学中的重要的DNA大分子，又应用了属于研究前沿的单分子实验技术，而物理学原理则是基本的热力学的能量均分定理.该实验可以很好地让学生与研究前沿接轨，并对物理学在生物学中的应用有初步的认识.

2 实验装置与实验原理

实验装置如图1所示.整个实验在一倒置显微镜（Nikon－TE2000U）上进行.样品池（图2）由2片载玻片夹住1片侧面抛光的盖玻片并用玻璃胶密封构成.上面载玻片钻有2个直径约1mm的小孔，玻璃管从小孔中接出并与硅胶管相连，一根硅胶管连接微注射泵，另一根接样品溶液.通过调节微注射泵（保定兰格）的流速和拉伸方式，可使样品进入或流出样品池.一端带有磁球而另一端带有地高辛的DNA溶液引入后可通过地高辛和抗地高辛之间的特异结合，连接在铺好抗地高辛的抛光盖玻片侧壁上，形成如图3所示结构.样品池一侧有安装在手动微操纵仪上的永磁铁，通过吸引磁球对DNA施加拉力，可以通过改变永磁铁的位置来改变磁力大小.样品池内显微镜成像通过外接CCD（维视图像，VS－808HC）以每秒25帧成像实时传送到计算机主机上安装的图像采集卡（微视图像，MV－200），并录像保存视频供分析.

图1 实验装置图

图2 样品池

图3 实验设计

磁球在焦平面x方向的运动相当于阻尼摆运动.热涨落倾向于让小球偏离平衡位置δx，导致x方向回复力Fx＝－Fsinθ与之抗衡，这里θ为摆偏离平衡位置夹角，F为垂直于x方向的外力.由于θ较小，sinθ≈θ＝δx／〈L〉，于是有Fx≈－Fδx／〈L〉＝－kxδx，其中〈L〉为DNA的末端距长度即磁球到侧壁的距离，kx＝F／〈L〉是该阻尼摆的有效劲度.这样摆的小角度的x方向运动可以看作一维谐振子运动，其能量等于kx〈δx2〉／2，而根据能量均分定理，小球在垂直磁场方向即x方向自由度上的能量为KBT／2，这样KBT／2＝kx〈δx2〉／2＝F〈δx2〉／（2〈L〉），得到：

其中KB为玻尔兹曼常量，T为热力学温度，〈δx2〉为磁球布朗运动x方向的均方差[4－6].磁球的运动轨迹利用基于快速傅里叶变换的自相关算法程序[6]分析采集的视频得到.δx和〈L〉可通过图像分析直接得到，并通过（1）式求得外力大小.

磷酸盐缓冲液（PBS）溶液的配制方法：16mL 0.2mmol／L的NaH2PO4·2H2O与84mL 0.2mmol／L的Na2HPO4·12H2O混合得到100mL的PBS溶液，再加入NaCl达到140mmol／L.然后对其进行过滤以待用.该缓冲液的pH值为7.5.

DNA样品制备：采用lambda DNA（New England Biolab）用于实验，其两端各有12个碱基的缺口，定制与缺口互补并且分别修饰有生物素和地高辛功能基的12个碱基的寡核酸片断，利用T4连接酶将2个片断互补连上得到两端修饰的DNA[7].实验时先将DNA与2.8μm修饰有链亲和素的顺磁球（dynal biotech）混合，因为生物素与链亲和素能够形成共价键，这样就得到了连有磁球的DNA.

3 结果与讨论

图4为分析得到的不同外力下磁球在平行于侧壁方向的运动轨迹，其波动幅度直接反映了所受外力的大小.可以观察到施加外力越大，波动幅度越小；反之则越大.对δx2进行统计平均得到〈δx2〉，进一步由式（1）可求出此时DNA所受的力的大小.对图4所示的各种外力下的δx进行统计后，可以得到其各自的统计分布图，如图5所示.可以看到δx的分布满足典型的高斯分布.力越大，分布峰值越高，半峰全宽也越窄.作为一种辅助手段，观察δx分布是否满足高斯分布可以判断所采集的数据帧是否足够多，以用于准确计算δx2的统计平均值.

图4 不同外力作用下磁球在平行于侧壁方向的运动轨迹图

图5 对应于图4的不同外力下δx的统计分布（图中每个柱状的宽度均为0.02μm）

通过移动磁铁改变施加的力的大小，得到了一系列DNA相对伸长量L／L0（L0为DNA完全拉直后的轮廓长度，lamnda DNA约为16.4μm）随外力变化的数据.

在0.1～10pN范围内，DNA的力学反应行为可以用蠕虫状链（worm－like－chain，WLC）模型来描述[8].根据该模型为：

其中KB是玻尔兹曼常量，T是热力学温度，L0是DNA完全舒展时的长度，F为外力，L是DNA的末端距长度，A为DNA的持久长度，是高分子物理学中用来衡量高分子刚性的一个参量.在0.2mmol／L PBS＋140mmol／L NaCl的溶液环境中，DNA的持久长度A为50nm左右.代入A值，室温T＝298K后，作图得到该模型函数图，如图6实线所示，与实验结果符合良好.

图6 测量得到的不同外力下DNA的相对伸长数据以及蠕虫状链模型拟合曲线

由于该测力方法原理是基于统计平均，不可避免地会出现统计误差.如果统计数据量不足，则会造成测量的偏差.一般数据采集量宜至少大于1 500个，即采集分析1min帧率25帧／s的视频数据，才能较好地控制偏差.采集时间超过2min即3 000帧数据后，其测力偏差不超过5%.此外，当所施加的磁力小于0.5pN时，由于磁球会靠近侧壁，侧壁表面可能会与之作用从而影响测量，因此实际测量中，一般将DNA的末端距长度保持在大于9μm.

在教学过程中，学生亲自动手采集不同磁力大小下的实验视频，然后离线分析，得到DNA所受力的大小及DNA的末端距平均长度，画出如图6所示的数据图，然后与蠕虫状链模型相对照.

在上述实验的基础上，可以进一步面向学生开展DNA与各种作用因子相互作用等直接面向科研的设计型实验研究.通过向样品池中导入可以与DNA相互作用的蛋白、活性剂等作用因子，分析磁球的运动可得到DNA末端距随时间变化的曲线.分析这些曲线可以直接得到其作用机理和形成的结构信息.具体的研究实例可以参见文献[9]和[10].

4 结束语

介绍了DNA力学性质测量的近代物理实验.该实验在培养学生动手和数据处理能力的同时，加深物理学专业学生对生物与物理相互交融趋势的理解，对具体的生物物理科学研究有初步的感性认识.

[1] 冉诗勇，孙博，李明.单分子操纵与单分子生物物理[J].物理，2007，36（3）：228－235.

[2] Ran Shi－yong，Wang Xiao－ling，Fu Wen－bo，et al.Single molecule DNA compaction by purified his－tones[J].Chinese Science Bulletin，2008，53（6）：836－841.

[3] 王晓玲，张兴华，魏孔吉，等.一种改进型单分子操纵装置及其应用[J].物理学报，2008，57（6）：3905－3911.

[4] Strick，T R，Allemand J F，Bensimon D，et al.Behavior of supercoiled DNA[J].Biophysical Journal，1998，74（4）：2016－2028.

[5] 王诚泰.统计物理学[M].北京：清华大学出版社，1991：343－345.

[6] Feyman R P，Leighton R B，Sands M.费恩曼物理学讲义（第一卷）[M].上海：上海科学技术出版社，2006：422－423.

[7] Smith S B，Finzi L，Bustamante C.Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads[J].Science，1992，258：1122－1126.

[8] Bustamante C，Marko J F，Siggia E D，et al.Entropic elasticity ofλ－phage DNA[J].Science，1994，265：1599－1600.

[9] Ran Shi－yong，Wang Yan－wei，Yang Guang－can，et al.Morphology characterization and single－molecule study of DNA－dodecyltrimethylammonium bromide complex[J].Journal of Physical Chemistry B，2011，115（16）：4568－4575.

[10] Wang Yan－wei，Ran Shi－yong，Man Bao－yuan，etal.Ethanol induces condensation of single DNA molecules[J].Soft Matter，2011，7：4425－4434.