ANCA相关性血管炎存在血管内皮细胞血栓调节蛋白以及内皮源性一氧化氮合酶弥漫性丢失

李颖 漆学良 张巍 王朝霞 冯立群 袁云

ANCA相关性血管炎存在血管内皮细胞血栓调节蛋白以及内皮源性一氧化氮合酶弥漫性丢失

李颖*漆学良※张巍△王朝霞△冯立群*袁云△

目的 探索ANCA相关性血管炎(antineutrophil cytoplasmic antibody－associated vasculitis，AAV)微小动脉和静脉的血管内皮细胞膜结合性血栓调节蛋白(thrombomodulin，TM)、内皮源性一氧化氮合酶(endothelial－nitric oxide synthase，eNOS)的表达规律。方法 12例经过临床、血清免疫学检查证实的AAV患者，2例Wegerner肉芽肿、5例显微镜下多血管炎和5例Churg－Strause综合征。Birmingham血管炎活动评分提示疾病处于活动期。均进行腓肠神经活检标本的常规组织学染色以及以抗CD68、CD3、CD20、血栓调节蛋白(thrombomodulin，TM)、eNOS以及第八因子(von Willebrand factor，vWF)抗体为第一抗体的免疫组织化学染色，以正常血管为对照。结果 12例患者的腓肠神经病理检查发现9例活动性血管炎，可见大量CD68阳性单核细胞和CD3阳性淋巴细胞浸润。和对照组相比，所有患者微小动脉和毛细血管内皮细胞eNOS和TM减低或消失，包括无炎细胞浸润血管，其中eNOS的下降程度较TM更明显。Churg－Strause综合征的血管内皮细胞eNOS和TM下降最显著。结论 AAV外周血管存在血管内皮细胞TM和eNOS弥漫性下降，两者下降程度在AAV不同亚型之间存在差异。

抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎 腓肠神经活检 血栓调节蛋白 内皮源性一氧化氮合酶

抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎(antineutro－ phil cytoplasmic antibody－associated vasculitis，AAV)是一类原发性系统性小血管炎，包括 Wegerner肉芽肿(wegerner granulomatosis，WG)、显微镜下多血管炎(microscopic polyangiitis，MPA)和 Churg－Strause 综 合 征(Churg－Strause syndrome，CSS)［1］。病理改变特点是小动脉、微动脉和小静脉的管壁出现节段性纤维素样坏死伴随淋巴－单核细胞浸润。其诊断主要依靠血管炎临床症状以及血清ANCA阳性，病理检查发现坏死性血管炎可以进一步确诊此病［2］。

内皮源性一氧化氮合酶(endothelial nitricoxide synthase，eNOS)是血管内皮细胞中一种能够通过精氨酸合成一氧化氮的酶，而血管内皮细胞膜结合的血栓调节蛋白(thrombomodulin，TM)是抗凝血过程中凝血酶的高亲和力受体。TM可以传递信号到eNOS调节蛋白偶联受体，两者在抗血栓和抗炎过程中发挥重要的作用。血管内皮细胞TM和eNOS减少可以出现在以微血管损害为主的皮肌炎患者［3］，AAV患者外周血管内皮细胞TM和eNOS存在哪些变化还缺乏系统性研究，为此我们对12例经过临床和血清学证实的AAV患者进行腓肠神经活检标本的免疫组化研究，以探讨腓肠神经滋养血管内皮细胞中TM和eNOS的改变规律。

1 材料与方法

1.1 临床资料 本实验纳入2005年5月到2008年12月之间在北京大学第一医院神经内科就诊的12例患者，诊断标准参考1998年日本修订的WG、CSS以及MPA的诊断标准［4］，其中 WG2例、MPA5例和 CSS5例。男5例、女7例，发病年龄28～75岁，平均(55.3±12.5)岁。所有患者均出现下肢为主的麻木、疼痛，其中肢体无力伴肌萎缩10例，发热8例，肾脏损害7例，呼吸道症状合并关节疼痛5例，视力下降和皮肤损害各3例，副鼻窦炎并听力下降2例，腹痛为主要表现的消化道症状2例，心脏损害1例。Birmingham血管炎活动评分为11～28分。

12 例患者有11例出现血清ANCA抗体阳性，其中MPO阳性5例、可疑阳性2例，PR3和IIF阳性各2例，1例CSS患者为阴性。肌电图检查和周围神经传导速度检查均提示存在周围神经损害。

1.2 研究方法 经过知情同意，对患者进行腓肠神经活检。腓肠神经标本进行石蜡包埋、切片和下列染色:①常规组织学染色，包括苏木精－伊红染色(HE)、LFB－HE染色和刚果红染色;②免疫组化染色(EnVision二步法)，第一抗体为(血栓调节素)TM、(8因子)vWF抗体、eNOS抗体、CD3抗体、CD20抗体及 CD68抗体。在免疫组织化学染色中血管内皮细胞呈棕黄色反应为阳性，根据染色强度分3级，阴性为血管内膜无着色，弱阳性为轻度或部分着色，阳性为明显均匀的着色。非血管炎腓肠神经标本对照组也进行 vWF、eNOS、TM的免疫组织化学染色。

2 结果

12 例患者中9例神经外衣可见活动性血管炎，受累血管直径主要在20～438μm之间。9例患者小动脉出现血管内膜肥厚和纤维素样坏死，血管中层平滑肌细胞间及血管外膜大量单核细胞和淋巴细胞浸润(图1)，每例患者都可以看到个别血管仅出现血管内膜或外膜炎细胞浸润，7例观察到小血管内膜纤维性增生及新生血管再通现象。9例患者微动脉出现内膜增生和管腔闭塞，在血管壁及周围出现炎细胞浸润。许多小静脉周围也可看到不同程度炎细胞浸润。有3例患者未发现明显血管炎性改变。12例患者均出现神经束内毛细血管增生以及内皮细胞肥大。12例患者均出现中到重度轴索性周围神经病病理改变，可见不同程度有髓神经纤维丢失。

免疫组织化学染色显示9例患者血管壁及周围出现CD68阳性单核细胞和CD3阳性T淋巴细胞浸润，3例患者血管周围可见少量CD20阳性B淋巴细胞浸润。此外，CD68阳性单核细胞出现在所有患者的神经束内、神经束衣、神经外衣，并可见泡沫细胞形成。

患者和正常对照的毛细血管以及微小血管内皮细胞vWF均呈阳性表达。所有患者不同直径的微小动脉和静脉以及毛细血管，包括没有出现血管炎性损害的血管，均出现内皮细胞eNOS表达下降(图2b)。6例eNOS表达为阴性，其中4例为CSS，2例为MPA患者。对照组的血管内皮细胞eNOS均阳性(图2a)。所有患者不同直径的微小动脉和静脉血管及毛细血管均出现内皮细胞TM表达下降，包括无血管炎改变的血管(图3a)，其中3例为阴性，均为CSS患者。对照组血管内皮细胞TM为阳性(图3b)。

3 讨论

腓肠神经的滋养血管为小动脉和微动脉，是AAV最易累及的血管［5］。本组患者出现感觉神经损害为主的周围神经病，提示腓肠神经的滋养血管被累及，Birmingham血管炎活动评分提示疾病处于活动期，研究这些血管可以反映AAV的血管病变规律。

病理检查可以发现部分血管存在炎细胞浸润，而部分血管组织学检查无明显异常。我们发现AAV各亚型在炎性活动期血管内皮的eNOS表达显著下降甚至完全丧失，在相对完整的微小动脉及毛细血管内皮也出现表达下降。文献报告类似的改变也出现在AAV的肾小球的毛细血管［6］，提示血管内皮细胞损伤非常广泛［3］。我们发现AAV亚型中CSS的血管改变最显著，而MPA和WG的血管内皮细胞还存在部分eNOS阳性表达，说明eNOS表达下降在不同的亚型之间存在差异。

表1 12例AAV患者的临床症状总结

图1 小动脉内膜纤维素样坏死，中层平滑肌炎细胞浸润(例1，HE染色400×)图2A 血管内皮细胞eNOS正常阳性表达(对照1，En Vision二步法400×)图2B 血管内皮细胞eNOS无阳性表达(例8，En Vision二步法400×)图3A 血管内皮细胞TM正常阳性表达(对照1，En Vision二步法400×)图3B 血管内皮细胞TM无阳性表达(例11，En Vision二步法400×)

Heeringa P等［6］在WG患者的研究中发现肾小球毛细血管eNOS丢失伴随内皮细胞CD31丢失，认为与局部炎细胞浸润导致内皮细胞损伤有关。我们发现许多血管的内皮细胞vWF染色正常，提示这些血管的内皮细胞还存在，特别是在非炎细胞浸润的血管，尽管有血管内皮细胞eNOS脱失，但显然不能单纯归结于局部炎细胞对内皮细胞的直接损害。我们推测血管炎出现的多种炎性细胞因子增加［7－8］是导致弥漫性血管内皮细胞eNOS的脱失的主要原因之一，因肿瘤坏死因子以及脂多糖物质可以在mRNA水平、蛋白表达稳定以及二聚化方面下调eNOS表达［9］，导致体外培养的血管内皮细胞eNOS下降。最近发现eNOS的基因多态性与闭塞性血管炎的发生有关［10］，AAV也存在eNOS的基因多态性，不排除在发病前已存在eNOS下降的可能性。

在不同类型AAV中，血管内皮细胞膜结合的TM在血管内皮细胞呈弥漫性脱失，与eNOS具有类似的规律，但下降程度比eNOS小，在不同的AAV患者中TM下降程度存在很大差异。AAV血液内TM的增加［11］可能与内皮细胞膜结合的TM脱失有关，而TM脱失也可能和eNOS下降一样，和血液内各种炎性因子增加有关，特别是肿瘤坏死因子［12］。高剂量的地塞米松可以下调TM的表达［13］，使血管内皮细胞膜结合的TM减少，进一步加重TM的抗血栓、抗炎和抗凋亡功能障碍。

总之，AAV血管炎症细胞浸润具有节段性，但血管内皮细胞的损伤具有弥漫性的特点，这种改变在不同类型AAV之间存在差异，其减少可能不是炎细胞的直接作用。在治疗AAV的过程中应当给予抗血栓治疗。

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Diffuse reduction of endothelial-nitric oxide synthase and thrombomodulin in vascular endothelium in patients with ANCA.

LIYing，QIXueliang，ZHANGWei，WANG Zhaoxia，FENG Liqun，YUAN Yun.Department of Neurology，Beijing University First Hospital，Beijing，100034，China，Tel:010 －83572588.

ObjectiveTo investigate the expression features of endothelial－nitric oxide synthase and thrombomodulin in vascular endothelium of the arteriolar and venule wall in patients with ANCA associated vasculitis.MethodsWe collected 12 patientswith ANCA associated vasculitis confirmed by clinical and serum immunological diagnosis，including 2 cases ofWegerner granulomatosis，5 cases ofmicroscopic polyangiitis and 5 cases of Churg－Strause syndrome.Sural nerve biopsiesweremade in all patients.The specimens were stained with routine histological and immunohistological stainings with first antibodies aganist CD 68，CD 20，CD 4，von Willebrand Factor，the endothelial－nitric oxide synthase(eNOS)and the thrombomodulin(TM).ResultsNine of 12 patients with active vasculitis had numerous CD68 positive macrophage and CD3 positive T－lymphocytes infiltrating.Compared with the normal control，the expression of eNOSand TM were significantly decreased or totally disappeared in the vascular endothelium of capillaries，arterioles and venuels，including the vessel without inflammatory infiltrating.The reduction in eNOSand TM expression weremore obvious in Churg－Strause syndrome among three types of AAV.The decrease in eNOSexpression wasmore profound than TM.ConclusionThere is diffuse reduction of eNOS and TM expression in vascular endothelium in patients with AAV and the reduction varies among three types of AAV.

Antineutrophil cytoplasmic antibody－associated vasculitis Sural nerve biopsy Endothelial－nitric oxide synthase Thrombomodulin

※南昌大学第二附属医院神经内科

R593.2

A

* 首都医科大学附属北京安贞医院神经内科(北京 100029)

E－mail:yuanyun2002@sohu.com)

△北京大学第一医院神经内科

2010－11－18)

(责任编辑:李 立)

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