肺腺癌VEGF－C的表达与MVD、MLVD及淋巴转移的关系

董晓鹏 肖天辉 赵小刚 (山东大学第二医院胸外科，山东 济南 250033)

肺腺癌VEGF－C的表达与MVD、MLVD及淋巴转移的关系

董晓鹏 肖天辉 赵小刚 (山东大学第二医院胸外科，山东 济南 250033)

目的 探讨肺腺癌血管内皮生长因子－C(VEGF－C)表达与微淋巴管密度(MLVD)、微血管密度(MVD)及淋巴转移之间的关系。方法 RT－PCR法检测36例肺腺癌组织中VEGF－C mRNA的表达，并以免疫组化法检测肺癌组织VEGF－C蛋白的表达、MLVD及MVD。结果 VEGF－C mRNA在肺腺癌组织中的表达比正常肺组织相对较高(P＜0.01)。VEGF－C蛋白表达在肿瘤周边部位显著高于肿瘤中心部位(P=0.015);其表达与肿瘤分化程度无关，与肿瘤的TNM分期有关，Ⅲ～Ⅳ期显著高于Ⅰ～Ⅱ期(P=0.026)。在VEGF－C蛋白阳性组，MVD高于阴性组(P=0.020)，MLVD显著高于阴性组(P=0.008)，淋巴结转移增多(P=0.039)。结论 VEGF－C mRNA在肺腺癌组织中高表达，VEGF－C蛋白表达与肺腺癌血管生成及淋巴管生成和淋巴结转移关系密切。

肺肿瘤;血管内皮生长因子;血管内皮生长因子受体－3;CD34

尽管化疗、放疗已经有了很大的进步，但肺癌长期生存率并未明显提高，尤其是肺腺癌，早期即可发生血液和淋巴转移，预后极差;因而研究肺腺癌的血管和淋巴管生成及转移的相关机制，寻找阻断其血液和淋巴转移的新方法，具有非常重要的意义。血管内皮生长因子(VEGF－C)是VEGF家族的重要成员，是参与肿瘤血管生成和淋巴管生成的重要血管生成因子〔1，2〕，本文对肺腺癌组织中 VEGF－C、微淋巴管密度(MLVD)和微血管密度(MVD)进行了检测，探讨 VEGF－C与 MLVD、MVD及淋巴结转移之间的相关关系。

1 材料与方法

1.1 材料 收集山东大学第二医院36例肺腺癌组织标本，其中男20例，女16例，年龄35～78〔平均(52.6±18.2)〕岁。高分化癌16例，中、低分化癌20例;TNM分期Ⅰ～Ⅱ期14例，Ⅲ～Ⅳ期22例。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂和引物 采用RT－PCR法参照有关文献设计相应引物，中科院上海生化所合成。引物序列:VEGF－C:5′－TGCCGATGCATGTCTAAACT－3′， 5′－TGAACAGGTCTCTTCATCCAGC－3′，249 bp;β－actin;5′－ATCATGTTTGAGACCTTCAACA－3′，5′－CATCTCTTGCTCGAAGTCCA－3′，317 bp。

1.2.2 cDNA制备 提取总RNA采用贝西生物技术有限公司RT－PCR试剂盒。取总 RNA 1 μg，加入 DEPC 处理 0.5 ml Eppendorf管中，组成 20 μl逆转录反应体系中，于 37℃，1 h，95℃10 min灭活鼠白血病病毒(MMLV)，终止逆转录。在上述20 μl RT产物的0.5 ml Eppendorf管中继续加入试剂，组成PCR反应体系。快速离心混匀;95℃ 5 min，离心使蒸汽沉于管底，加入2 μl(1 U/μl)TaqDNA 聚合物。快速离心混匀;加入100 μl液体石蜡。循环条件:94℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃ 1 min，循环 35次，最后一个循环72℃延长7 min。1.5%琼脂糖电泳鉴定。用凝胶成像分析系统测出VEGF－C和β－actin mRNA的表达强度或计算相对系数。相对系数=特异性基因表达强度/β－actin表达强度。

1.2.3 免疫组织化学 将肺肿瘤标本用10%甲醛固定24 h后取材，脱水后石蜡包埋，所有蜡块连续切片3张，每张厚5 μm，切片常规脱蜡，微波抗原修复。VEGF－C、VEGF 受体－3(VEGFR－3)多克隆抗体(北京中杉)按1∶200稀释，按试剂盒(福州迈新公司)说明进行，最后DAB显色，常规复染封片。用已知的阳性切片作阳性对照，PBS代替VEGF－C、VEGFR－3多克隆抗体作阴性对照。鼠抗人CD34单克隆抗体(北京中杉)工作液浓度1∶80，均为浓缩型产品。用已知的乳腺癌标本作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。VEGF－C免疫组化结果判断:以细胞质呈现棕黄色颗粒为VEGF－C阳性细胞，每例切片至少计数10个400倍视野，计数阳性细胞占所有细胞的百分数，阳性细胞数＞25%为VEGF－C蛋白表达阳性。CD34阳性微血管结果判断及计数方法:先在低倍镜(100倍)下全面观察切片，寻找血管高密度区，再在400倍视野下以与周围肿瘤细胞和结缔组织成分有明显区别的、任何一个染成棕黄色的内皮细胞簇认为是一个微血管，只要结构不相连，其分支结构也作为一个血管进行计数，管腔＞8个红细胞大小或带有肌层的血管均不计数。记录5个高倍视野内的微血管数，其平均值作为每例的MVD。VEGFR－3阳性微淋巴管结果判断及计数方法:淋巴管主要分布在癌周组织，管腔较大，数量多，肿瘤内部未见成形的淋巴管样结构。在低倍镜(100倍)下寻找VEGFR－3阳性脉管密集区，换高倍镜(400倍)选取5个视野计数，其平均值作为每例的MLVD。

1.3 统计学分析 以SPSS12.0统计软件，计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验或精确概率法。

2 结果

2.1 VEGF－C mRNA在肺腺癌组织的表达 肺腺癌组织及其相应正常肺组织中VEGF－C mRNA都有不同程度的表达，在肺腺癌组织中高表达(0.644±0.109)，在正常肺组织中低表达(0.334±0.104)(P＜0.01)。见图1。

2.2 VEGF－C表达与肺腺癌的临床病理关系 VEGF－C阳性物质呈棕黄色细颗粒状，主要位于癌细胞胞质，胞膜也有不同程度表达，有时亦见于癌组织间质脉管内皮细胞。VEGF－C表达有异质性，肿瘤边缘的癌组织表达相对较强(26/36)，肿瘤内部相对较弱(12/36)(P=0.015)。VEGF－C表达与肿瘤分化程度无关，与肿瘤的TNM分期有关，14例Ⅰ～Ⅱ期标本中有7例表达阳性，而22例Ⅲ～Ⅳ期标本中有19例阳性，Ⅲ～Ⅳ期显著高于Ⅰ～Ⅱ期(P=0.026)。见图1。

2.3 VEGF－C蛋白与MVD、MLVD的关系 CD34阳性染色位于微血管内皮细胞，癌组织中微血管形态不规整，分布不均;癌灶边缘血管最密集，成簇状，部分呈发芽状。VEGF－C阳性组MVD显著高于阴性组(P=0.020)。见图1，表1。

VEGFR－3主要表达在癌巢周围间质脉管内皮细胞，肿瘤细胞偶见阳性反应，染色较弱。VEGFR－3阳性脉管呈管腔状、条索状，弥漫或散在分布在癌巢周围间质，常可见癌细胞浸润。微淋巴管主要分布在癌周组织，管腔大，数量多，肿瘤内部未见成形的淋巴管样结构。VEGF－C阳性组MLVD显著高于阴性组(P=0.008)。见图1，表1。

2.4 VEGF－C蛋白与淋巴结转移的关系 在VEGF－C阳性的26例病人中，21例淋巴结转移，10例阴性病人中有4例淋巴结转移(P=0.039)。见表1。

表1 肺腺癌组织中VEGF-C蛋白与MVD、MLVD及淋巴结转移的关系

图1VEGF-C mRNA、VEGF-C阳性、CD34阳性及VEGFR-3阳性表达

3 讨论

VEGF－C 是 VEGF－C 家族的重要成员，VEGF－C 与 VEGFR－2结合参与血管生成的调控，与VEGFR－3结合则调控淋巴管生成〔1，2〕。温剑虎等〔3〕发现肺癌肿瘤周边与正常组织交界处的浸润区域、增生活跃区域的间质中存在着显著高于肿瘤中心的血管生成。CD34是一种高度糖基化的Ⅰ型跨膜蛋白，主要表达在血管内皮细胞，在众多血管内皮细胞标记物中CD34更具敏感性和特异性，易于观察，是作为计算MVD的依据。本文提示VEGF－C的表达与肺腺癌血管生成关系密切。

在许多人类肿瘤包括恶性黑色素瘤、肺癌和胃癌〔4〕等中均发现有VEGF－C的表达，并促进这些肿瘤的淋巴管生成和淋巴转移，本研究发现VEGF－C mRNA在肺腺癌组织及其相应正常肺组织都有不同程度的表达，癌组织中VEGF－C呈高表达，而正常肺组织表达相对较低。动物实验已证实肿瘤细胞可以通过表达淋巴管生成调控因子VEGF－C诱导淋巴管生成，促进肿瘤细胞淋巴道转移〔5〕，本文以VEGFR－3阳性染色作为MLVD计数的依据，VEGFR－3作为淋巴管内皮标记物，已在研究中较多应用〔6〕，实验发现，肺腺癌VEGF－C蛋白阳性组 MLVD比阴性组显著增加，淋巴结转移增多，说明VEGF－C的表达与肺腺癌淋巴管的生成和淋巴转移关系密切。Onogawa等〔7〕在结肠癌中发现VEGF－C蛋白表达于肿瘤细胞浸润边缘，即肿瘤细胞与宿主细胞相连处表达最强，且VEGF－C表达与结肠癌浸润深度、淋巴管侵犯、淋巴结转移相关，阳性患者生存时间明显短于阴性表达的患者。Hung等〔8〕发现易发生淋巴道转移的甲状腺乳头状癌VEGF－C蛋白表达显著高于正常组织，在易发生血管转移的髓样癌表达显著下降。VEGF－C表达促进肿瘤转移机制可能是促进淋巴管内皮增生，淋巴管数目增多，增大了瘤细胞与淋巴管内皮接触的表面积;增加脉管的通透性;改变淋巴管内皮黏附特性或表面趋化因子的表达〔9〕。VEGF－C的表达促进了新生淋巴管的生成，并进而促进了肿瘤淋巴转移。

1 Yancopoulos GD，Davis S，Gale NW，et al.Vascular－specific growth factors and blood vessel formation〔J〕.Nature，2000;407(6801):242－8.

2 Makinen T，Veikkola T，Mustjoki S，et al.Isolated lymphatic endothelial cells transduce growth，survival and migratory signals via the VEGF－C/D receptor VEGFR－3〔J〕.EMBO J，2001;20(17):4762－73.

3 温剑虎，朱 冰.抗CD34单抗标记血管生成在非小细胞肺癌中的表达及临床意义〔J〕. 免疫学杂志，2000;16(4):289－91.

4 Ishikawa M，Kitayama J，Kazama S，et al.Expression of vascular endothelial growth factor(VEGF)－C in preoperative biopsy specimens and metastatic foci of regional lymph nodes in submucosal gastric carcinoma〔J〕.World J Surg Oncol，2005;3(1):2.

5 Makinen T，Jussila L，Veikkola T，et al.Inhibition of lymphangiogenesis with resulting lymphedema in transgenic mice expressing soluble VEGF receptor－3〔J〕.Nat Med，2001;7(2):199－205.

6 吕志强，李海刚，谢德荣，等.非小细胞肺癌组织中VEGF－C和VEGFR－3 的表达及其临床意义〔J〕. 癌症，2005;24(9):1132－5.

7 Onogawa S，Kitadai Y，Tanaka S，et al.Expression of VEGF－C and VEGFD at the invasive edge correlates with lymph node metastasis and prognosis of patients with colorectal carcinoma〔J〕.Cancer Sci，2004;95(1):32－9.

8 Hung CJ，Ginzinger DG，Zarneger R，et al.Expression of vascular endothelial growth factor－C in benign and malignant thyroid tumors〔J〕.J Clin Endocrinol Metab，2003;88(8):3694－9.

9 Nathanson SD.Insights into the mechanisms of lymph node metastasis〔J〕.Cancer，2003;98(2):413－23.

Impact of VEGF-C expression on MVD，MLVD and lymph-node metastasis of lung adenocarcinoma

DONG Xiao-Peng，XIAO Tian-Hui，ZHAO Xiao-Gang.
Department of Thoracic Surgery，Second Hospital of Shandong University，Jinan 250033，Shandong，China

ObjectiveTo investigate the relationship of vascular endothelial growth factor－C(VEGF－C)，microlymphatic vessel density(MLV)，microvessel density(MVD)and lymph node metastasis in lung adenocarcinoma.Methods The expression of VEGF－C mRNA was detected by semi－quantitive reverse transcriptase－ polymerase chain reaction method and the expression of VEGF－C，MLVD and MVD was assayed by immunohistochemistry in 36 cases with lung adenocarcinoma.Results Expression of VEGF－C mRNA was higher in lung cancer than that in normal lung tissue.Among 36 cases of lung adenocarcinoma，the positive rate of VEGF－C mRNA was 72.2%(26/36).The expression of VEGF－C in cancerous invasive edge was significantly higher than that in the center of cancerous tissues(P=0.015). Ⅲ ～Ⅳstages of lung adenocarcinoma showed strong expressions of VEGF－C thanⅠ ～Ⅱ stages(P=0.026).The MVD，MLVD and positive lymph node in positive VEGF－C group were higher than those in the negative group.Conclusions Expression of VEGF－C mRNA is high，and the expression of VEGF－C is related with the angiogenesis，lymphangiogenesis and lymph node metastasis in lung adenocarcinoma.

Lung neoplasms;Vascular endothelial growth factor;Vascular endothelial growth factor receptor－3;CD34

R734.1

A

1005-9202(2011)12-2177-03

山东省自然科学基金青年基金(Q2007C12)

董晓鹏(1979－)，男，硕士，主治医师，主要从事肺癌的基础与临床研究。

〔2010－05－26 收稿 2011－02－28 修回〕

(编辑 袁左鸣/曹梦园)