冠心病发病与 C反应蛋白及其基因多态性的相关性研究

王彬

冠心病发病与 C反应蛋白及其基因多态性的相关性研究

王彬

目的 研究河南地区汉族人群血清C反应蛋白水平(CRP)及其1059G/C基因多态性与冠心病之间的关系。方法 采用全自动生化分析仪测定 286例冠状动脉造影患者的血清 CRP水平,同时应用聚合酶链反应检测 CRP的 1059G/C基因多态性,结合冠状动脉造影结果进行分析。结果 冠心病组的自然对数转换CRP(InCRP)水平显著高于对照组(P＜0.05),以年龄、性别、吸烟、高血压、体重指数和InCRP水平为自变量的Logistic回归分析,InCRP水平(Ro=1.44,P＜0.01)和体重指数(OR= 1.01,P＜0.05)与冠心病独立相关。1059G/C基因多态性等位基因和基因型的分布频率符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=0.297,P＞0.05)。两组的1059G/C基因型和等位基因的分布趋势相同,差异无显著性(P＞0.05)。C等位基因携带者的InCRP水平低于GG基因型(0.53±1.01比0.88±1.99 mg/l;P= 0.024),而冠状动脉病变程度不受1059G/C基因多态性的影响(χ2=1.374,P＞0.05)。结论 血清CRP水平升高可能是河南地区汉族人冠心病的独立危险因子;CRP水平可能受其 1059G/C基因多态性的影响。

冠心病;C反应蛋白;基因多态性

C反应蛋白(CRP)是一项敏感的反映机体炎症状态的指标。自从1994年采用Behring NA Latex CRP的生化定量测定提高了 CRP测定的灵敏度和精确度,大量前瞻性临床研究表明 CRP水平的升高与心血管疾病尤其是冠心病发病危险度升高密切相关[1-6]。最近NH IJBI FHS研究[7]发现遗传因素对血清GRP的水平发挥了35%～40%的作用,因此寻找CRP的基因标志日益受到人们的重视。2002年 5月美国 Zee等[8]在 1452例的 6.8年随访研究中发现,CRP基因第2外显的1059位G-C突变与血清CRP水平降低有关,并证实CRP水平升高是冠心病的独立危险因子之一。本研究旨在通过检测 286例行冠状动脉造影的患者血清高敏 CRP水平和1059G/C基因多态性,以了解河南地区汉族中该基因多态性频率,并讨其与CRP水平及冠心病之间的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选择于我院住院行冠状动脉造影的患者286例。应用Judkind法行冠状动脉造影,由2名有经验向医师分析造影结果。冠状动脉病变以血管直径狭窄程度＞50%为阳性,严重程度分为正常冠状动脉、1支病变、2支病变、3支病变。根据造影结果分为两组:①冠心病组:共 188例,其中心绞痛 108例,陈旧性心肌梗死 45例和急性心肌梗死 35例;②对照组:冠状动脉造影正常共 98例。所有研究对象均来自汉族人群,无血缘关系。

1.2 二研究方法

1.2.1 高血压诊断标准 采用《19991WHO/ISH高血压治疗指南》的分类标准,收缩压＞140mm Hg和(或)舒张压＞90 mm Hg。体重指数(BMI)=体重/身高(kg/m2)。

1.2.2 血湾高敏CRP的测定 所有人选对象于冠状动脉造影前一周内,采集清晨空腹静脉血 2m l,应用免疫比浊法检测血清CRP值(OLYMPUS AU 400 Analyzer)试剂由德国利得曼公司提供。

1.2.3 CRP的10599G/C基因型分析 抽取外周静脉血5 m l枸橼酸钠抗凝;采用低渗溶血法获得白细胞,以常规酚/氯仿抽提法提取DNA,TE溶解保存。应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR)核苷酸分型技术检测1059G/C基因多态性。根据 Cao等[9]提出的引物,序列如下:上游引物5'-GATCTGTGTGTGATCTGAGAAACCTCT-3'下游引物5'-GAGGTACCAGAGACAGAGACGTG-3'。PCR反应体系50μl,基因组DNA 100ng,10×PCR缓冲液5μl,200mmol/LdNTP, 1单位TaqDNA聚合酶。PCR反应条件:变性94℃5min;循环:94℃1 min,56℃1m in,72℃1 min,共35个循环;延伸72℃5m in。取纯化后PCR产物 20μl,限制性内切酶III (Roche)酶切。55℃水浴4h。酶切片段经2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色后通过UV凝胶成像系统判断结果。

1.2.4 统计学处理 用SPSS 10.0软件进行分析。基因型和等位基因频率采用直接计。研究对象与Hardy-Weinberg平衡的符合程度,基因型和等位基因频率的组间比较采用四格表 χ2检验和R×C列联表χ2检验。计量资料采用均数士标准差（±s)表示,主要检测指标均进行正态性检验,对于偏态分布的资料经对数转换达到近似正态分布,再进行 t检验。以 P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 两组的一般临床资科和血清CRP水平的比较(表1)由于血清CRP水平呈偏态分布,取其自然对数转换为In-CRP,经Kolmogorov-Sm irnov检验近似正态分布(z=0.977,P =0.296)。两组之间在年龄、性别、吸烟、高血压和体重指数等方面差异均无显著性(P＞0.05);但冠心病组的InCRP水平显著高于对照组(P＜0.05)(表1)。以年龄、性别、吸、高血压、体重指数和InCRP水平为自变的Logistic二回归分析显示,InCRP水平(OR=1.44,P＜0.01)和体重指数(OR= 1.01,P＜0.05)。与冠心病的危险性独立相关。

表1 两组一般临床资料和血清lnCRP水平比较

2.2 两组间1059G/C基因型和等位基因的分布 经PCR扩增片段大小为744bp,根据限制性内切酶MaeⅢ酶切的情况,表现为GG基因型(310 bp、233 bp、201 bp)、GC基因型(432bp、310 bp、233bp、201bp)和CC基因型(434 bp、310 bp)。在286例研究对象中GG、GC、CC基因型和G、C等位基因的分布频率为83.7、14.2、2.0和91.4、8.6,符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=0.297,P＞0.05)。冠心病和对照组的1059G/C基因型和等位基因的分布趋势相同,差异无显著性(P＞0.05)(表2)。

注:DNA分子量标志;1:PCR产物;2,4:GC基因型;3,6,7:GG基因型;5:CC基因型

3.3 1059G/C基因多态性对CRP和冠状动脉病变程度的影响 本研究中GG、GC和CC基因型的lnCRP水平分别为(0.88±0.99)、(0.54±1.04)、(0.33±0.53)lnmg/L,GG基因型的血清lnCRP水平(0.88±0.99)显著高于GC+CC基因型(0.53±1.01)lnmg/L(P＜0.05);而冠状动脉病变程度不受1059G/C基因多态性的影响(χ2=1.374,P＞0.05)(表3)。

表2 两组间 1059G/C基因型和等位基因的频率分布(例,%)

注:因CC基因型例数较少,与GC型合为一组;表3同此表

表3 1059G/C基因多态性与lnCRP和冠状动脉病变程度的关系

3 讨论

炎症在动脉粥样硬化性疾病的病程进展中起着显著的作用。C反应蛋白(CRP)是炎症急性相反应的标志物,正常情况下以微量形式存在于健康人的血清中。随着 CRP的高灵敏度测定的进展使人们相信 CRP是一种微炎症的指标,近年来的研究揭示高敏CRP水平与冠心病的发生过程直接相关,并能独立预测近期的远期心脏事件的发生,认为它是一个被低估了的未充分利用的指标[10]。MONICAAugsburg队列研究[2]对 936名表面健康的中年男性随访 8年,结果表明高敏CRP水平与冠状动脉疾病的发病率间存在显著的正相关关系。即时对于认为发生心血管疾病危险度低的女性来说, Ridker等[3]的研究结果也证实高敏CRP测定是12种标志物中(包括炎症、脂质和脂蛋白以及高半胱氨酸)心血管疾病最强的单变量预测因素。NSTACS研究[11]表明高敏CRP水平是非ST段抬高的急性冠状动脉综合征接受介入治疗后近期和远期病死率的独立预测因子。

本研究在 286例进行择期冠状动脉造影检查的人群中,冠心病组的血清高敏CRP水平显著高于对照组,以Logistic回归分析显示CRP和体重指数与造影证实的冠心病独立相关,表明高敏CRP水平升高的人群通过口服阿司匹林和他汀类药物进行抗炎治疗,可能会降低冠心病的发病危险度,内科医师健康研究 (PHS)[4]和胆固醇及复发事件研究(CARE)[12]的结果也对这一观点提供了有力的支持。

2000年加拿大Cao等[9]首次报道了CRP的第 2外显子的1059位GC突变,由于血清CRP水平与冠心病的关系,提出 1059G/C基因多态性可能为冠心病的候选基因。我们运用PCR-RFLP技术检测了286例研究对象的1059G/C基因多态性,发现河南地区汉族人中存在CRP的1059G/C基因多态性,1059C等位基因的频率为8.6%,GG基因型的高敏CRP水平显著高于GC+CC基因型,提示1059C等位基因与CRP基线水平降低相关,同时研究未发现 1059G/C基因多态性与冠心病发生和冠状动脉病变严重程度的相关性,这与 Zee等[8]的研究结果一致。有学者认为,由于 1059G/C基因突变没有改变氨基酸序列[9],它只是通过关联其他未被发现的 CRP基因功能突变或附近的基因来影响 CRP表达的水平,因此,虽然未能证实 1059G/C基因多态性本身能预测冠心病的发生,但是,本研究发现遗传因素可能影晌CRP的水平。CRP主要由白介素-6(IL-6)通过剂量依赖方式刺激肝细胞及活化巨噬细胞合成,Vickers等[13]研究发现IL-6的-174G/C基因多态性影响血清CRP水平表达,-174C等位基因与CRP基线水平高密切相关,并证实遗传因素对CRP水平起了39%的作用。

目前有关 CRP致动脉粥样硬化的机制尚不明确。近年研究表明 CRP可诱导单核细胞表达组织因子,激活凝血系统和补体系统,导致机体凝血、纤溶机制失衡,增加心血管事件的危险[10]。德国Hoffemeister等[14]的新近研究表明,在不稳定性心绞痛患者的急性期反应中,CRP水平高与致斑块不稳定的未端补体系统的激活有关,从而为理论上解释CRP对急性冠状动脉综合征的预测价值提供了依据。

我们的初步研究显示高敏 CRP水平升高可能是河南地区汉族人冠心病发生的独立危险因素,并可能受其 1059G/C基因多态性的影响。由于高敏CRP测定可能更好地预测心血管疾病的发病危险度,具有重大的临床和公共卫生意义,因此尚需要进一步大规模临床研究证实。

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Plasma C-reactive protein leveland the 1059G/C polymorphism of CRP in patientswith coronary artery disease

WANGBin.

Objective To investigate the relationship between plasma levelsof ultra-sensitive C-reactive protein(CRP)or1059G/C polymorphism and angiographically documented coronary artery disease(CHD)in Chinese.Methods Plasma level ofultra-sensitive CRPwas determined by Immunoturbidimetric analyzetr in288 patientsundergoing selective coronary angiography,and the 1059G/C polymorphism of CRP gene was screened by PCR.Results CHDgroup showed significantly higherp lasma levelof in CRP than controlgroup(P＜0.05) in CRP(OR=1.44,P＜0.01)and body mass index(OR=1.01,P＜0.05)were risk factors associated with CHD on logistic regression analysis.The allele and genotype frequencies were consistentwith that predicter by Hardy-Weinberg equilibrium in the present study population(χ2=0.297,P＞0.05).There was no significant difference between CHD group and control group for1059G/C polymorphism(P＞0.05).Plasma in CRP level wassignificantly lower among carriers of 1059C Allele as compared with non-carriers GG genotype(0.53± 1.01vs 0.88±1.99 mg/l;P=0.024)There was also no significant difference in the number of stenotic vessels by 1059G/C polymorphism(χ2=1.374,P＞0.05).Conclusion Baseline plasmaultra-sensitive Creactive proteinmaybe an independent risk factor of CHD and the levelmay be influenced by 1059G/C polymorphism of the CRP gene in Chinese.

Coronary artery disease;C-reactive protein;Gene polymorphism

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