急性分离大鼠皮层神经元的方法与体会

王 壮 ，刘 富 ，纪 慧 ，田 华

1.齐齐哈尔医学院成人及继续教育学院学工办，黑龙江齐齐哈尔 161006；2.齐齐哈尔医学院解剖教研室，黑龙江齐齐哈尔 161006；3.齐齐哈尔医学院基础医学院办公室，黑龙江齐齐哈尔 161006；4.齐齐哈尔医学院药理教研室，黑龙江齐齐哈尔 161006

近年来，研究细胞膜离子通道活动的主要方法是膜片钳技术，而获得活力好的神经元便成为应用膜片钳技术的重要先决条件。许多离子通道研究是需要单个分散的神经元，人工培养的神经细胞易受培养环境的影响，自身特性改变较大，而急性分离的细胞却能相对保持完好的生理特性[1-3]。笔者结合文献并加以改进，摸索出一种简便易行的适用于全细胞膜片钳研究的大鼠顶叶皮层神经元急性分离方法，现报道如下：

1 材料与方法

1.1 实验动物

Wistar大鼠，10～16 d，雌雄不限，由哈尔滨医科大学附属二院动物研究中心提供。

1.2 试剂

胰蛋白酶(Protease)、四乙胺(TEA)、4-氨基 吡啶(4-AP)、EGTA、HEPES、CsCl，均为 Sigma 公司产品，其余为国产分析纯试剂。

1.3 大鼠皮层神经元的急性分离

断头取大脑皮层，切成厚约0.4 mm的冠状脑片，置于通有95%O2和5%CO2混合气体的人工脑脊液[ACSF（mmol/L）：NaCl 142， KCl 5， CaCl22， MgSO42， D-Glucose 10， HEPES 10，pH 7.3，32℃]中孵育1 h后，再在通有95%O2和5%CO2混合气体的0.1%胰蛋白酶（用ACSF配制）溶液中消化30 min。消化好的脑片以ACSF冲洗、剪碎，以尖端抛光的Pasteur吸管（口径分别为 500、300、150 μm）依次吹打，使组织块分散，吹打成细胞悬液，静置2～4 min后，吸取上清液，滴于有饱和氧细胞外液（mmol/L，NaCl 130、KCl 5.4、CaCl21、MgCl21、Glucose 25、HEPES 10、CdCl20.2，pH7.3） 的培养皿中， 静置20 min细胞贴壁后进行膜片钳实验。整个实验在20～25℃下进行。

1.4 全细胞记录方

对神经元电生理的膜片钳研究，要求细胞的膜光滑完整、清洁、状态良好，破膜后对其细胞活性仍能保持很长一段时间[4]。选取状态良好的神经元进行实验。电极内预先灌注电极内液，通过三维微操纵仪使电极进入细胞外液，显示器上可见封接测试脉冲，其大小代表电极电流，并可显示据此计算出的电极电阻，通常为2～4 MΩ。当电极尖与细胞表面接触时，由于电极电阻的突然增加，电极电流会减小，细胞膜出现颤动，给予电极以一定的负压，显示器上的测试脉冲逐渐减小，成为直线，并出现大小相同、方向相反的电容瞬流，其由电极夹持器和电极管壁形成。此时电阻显示＞1 GΩ，表明形成高阻封接。调节放大器上的快电容补偿旋钮以抵消此电容电流。然后给予快速负压或向细胞膜施加以一短脉冲使电极吸附处的细胞膜破裂，电极液与细胞液相通从而形成全细胞记录。此时出现来自细胞膜较大的跨膜电流瞬流，调节放大器上的慢电容补偿旋钮和串联电阻补偿旋钮以抵消电容电流和串联电阻造成的电压降。即可在电压钳模式下，进行电流的观察和记录。数据分析用Clampfit 8.2软件处理。

2 结果

2.1 急性分离的大鼠皮层神经元形态学观察

倒置相差显微镜下，分离完整的神经元表面光洁，有较强的光晕，而且有较长的突起。细胞胞体呈现锥形、椭圆形或三角形，胞质均匀，折光性好；一般有1个顶树突和2个或多个基数突。完整的神经细胞在人工脑脊液中可维持其形状6 h以上（图 1）。

2.2 离子通道研究

用锥体细胞作为研究对象，利用前述标准细胞外液，采样参数文件保持电位-80 mV，从-40 mV去极化到+60 mV，共10个阶跃，每个阶跃增加10 mV去极化，脉冲宽度为100～300 ms，刺激频率为1 Hz。全细胞电压钳制条件下记录出的原始电流如图2A，可见电流分内向电流和外向电流，内向电流可被1 μmol/L河豚毒阻断，用CsCl代替电极内液的KCl，则外向电流被1 mmol/L 4-AP和10 mmol/L TEA大部分阻断，向该细胞附近添加TTX和4-AP后，可以记录到延迟整流钾电流IK（图2B）。在细胞外液中添加TTX和TEA后，可以记录到瞬间外向钾电流IA（图2C）。

3 讨论

3.1 动物的选择

理论上鼠龄越小的大鼠皮层神经元耐受缺氧能力越强，活性越好，分离的效果也越好。鼠龄过大神经元突起较多较长，分离时容易损伤，分离出来的细胞易于封接但破膜比较困难；鼠龄过小神经元未分化成熟，记录出的通道电流较小，且在破膜时负压稍大即可将细胞吸入电极内。根据本实验，选择鼠龄在10～16 d的幼鼠为宜，最佳时间为13 d。

3.2 大鼠皮层神经元的急性分离

膜片钳记录成功的关键是分离完整的、表面光洁的、存活时间较长的锥体细胞。急性分离过程中需要注意的主要关键问题如下：①电极内预先灌注电极内液，为防止电极尖的阻塞，可对电极液进行滤膜过滤。电极内可以给予正压以防止电极尖吸附灰尘和颗粒。②孵育及标准细胞外液pH值，酶浓度及作用时间是影响细胞状态的关键应严格控制。③脑片制备：取材时不要挤压脑组织，以免造成损伤。动作要迅速，脑片制备必须在通氧的冰ACSF中进行，脑片对缺氧敏感，在孵育及酶处理过程中必须连续供给氧气。通气时注意防止脑片随气泡翻动。④消化酶随用随配，防止酶活力下降[5-7]。酶解过程中的酶量与酶解时间要严格控制，酶量增加会导致细胞消化过度，膜片钳记录时间缩短；酶量不足导致细胞消化不够，不易破膜，难以形成全细胞膜片钳记录模式。⑤脑片薄厚切得要适中，过厚不利于氧气透过造成细胞缺氧，过薄则机械性损伤较大。⑥脑片吹打[8]：选择口径大小合适的吹打管，从粗到细依次吹打脑片（口径分别为 500、300、150 μm），效果较好。吸管直径过大或过小，均会造成损伤，不能得到状态良好的神经元。此外，吹打脑片动作要轻柔，否则加重细胞损伤。

本实验分离的大鼠皮层细胞具有明显的突起，细胞膜表面光洁、光晕好。用全细胞膜片钳技术在急性分离的细胞上记录到上述全细胞钠、钾电流，实验结果表明利用该方法急性分离皮层神经元，可用于膜片钳技术探究大脑皮层离子通道及其信号转导机制，为深入了解大脑皮层的功能及其相关疾病发生机制和药物治疗研究奠定基础。

[1]韩济生.神经科学原理 [M].2版.北京：北京医科大学出版社,1999：1084-1103.

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