TNF－α对小鼠脑微血管内皮细胞RhoA活性的影响*

邓小鹿， 彭 镜， 何 芳， 杨丽芬， 吴丽文， 尹 飞

(中南大学湘雅医院儿科，湖南长沙410008)

肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF － α)主要由单核细胞和巨细胞产生，在介导中枢神经系统感染的炎症过程中起着重要作用。本实验室前期研究证实，感染性脑水肿大鼠脑组织的TNF－α含量明显增高，与脑水肿的严重程度呈正相关［1］;Rho激酶抑制剂Y－27632可以减轻TNF－α导致的脑微血管内皮细胞通透性增高［2］。同时，已有研究显示RhoA/Rho激酶信号通路是调控内皮细胞屏障功能的重要环节，其中RhoA的活性由Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子(Rho guanine nucleotide exchange factors， RhoGEFs)催 化。p115RhoGEF是第一个被发现联系G蛋白偶联受体和Rho家族的RhoGEFs，介导多种刺激因素如凝血酶、溶血凝脂酸、血栓素－2对RhoA的活化［3］。因此，我们认为p115RhoGEF可能也参与了TNF－α对RhoA的调控，而目前未见相关文献报道。本研究检测了TNF－α刺激小鼠脑微血管内皮细胞不同时点RhoA活性和蛋白表达水平，并通过siRNA抑制p115RhoGEF表达，探讨其在TNF－α对RhoA活性调控中的作用。

材料和方法

1 材料

小鼠脑微血管内皮细胞株bEnd.3由美国芝加哥大学章坚教授馈赠，RhoA活性检测试剂盒购自Cytoskeleton，DMEM高糖培养基购自Thermo，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自杭州四季青公司，重组人TNF－α购自Sigma，兔抗RhoA单克隆抗体购自CST，山羊抗p115RhoGEF多克隆抗体和HRP标记的羊抗兔IgG购自Santa Cruz，p115RhoGEF siRNA由上海吉凯基因技术有限公司合成。其余生化试剂为国产分析纯试剂或进口分装。

2 方法

2.1 细胞培养 应用 DMEM(含 10%FBS)培养液，在37℃、5%CO2培养箱条件下培养bEnd.3细胞，每3 d按1∶2的比例传代，每日于倒置相差显微镜下观察细胞形态与生长状态，1－2 d更换1次培养液。

2.2 siRNA转染 参考文献［4］合成p115RhoGEF siRNA。合成引物序列如下:正义链5'－CAUACCAUCUCUACCGACGtt－3';反义链5'－CGUCGGUAGAGAUGGUAUGtt－3'。采用 Invitrogen公司的Lipofectamine 2000将p115RhoGEF siRNA转染bEnd.3细胞，无活性的nsRNA作为对照。转染72 h后，利用Western blotting验证siRNA抑制p115RhoGEF蛋白合成的效果。

2.3 RhoA活性和表达分析及分组 将bEnd.3细胞分为正常对照组和TNF－α刺激组。去血清培养24 h，加入TNF－α(10 μg/L)刺激，在 10、30、60 min 利用 pull－ down 法检测RhoA活性，得到TNF－α作用与RhoA活化的时效关系。取RhoA活化最明显的时点，bEnd.3细胞转染p115RhoGEF siRNA和nsRNA，检测TNF－α刺激后RhoA的活性变化。Pull－down法操作步骤依照Cytoskeleton提供的RhoA活性测定试剂盒说明书进行。Western blotting检测RhoA－GTP的表达，RhoA－GTP/总RhoA的比值代表RhoA活性。

将bEnd.3细胞分为正常对照组和TNF－α刺激组。去血清培养24h，分为1、3、6、12、24 h 组，加入 TNF － α(10 μg/L)进行预处理后收集各组总蛋白，Western blotting检测RhoA蛋白表达变化。

2.4 Western blotting 每孔加样品总蛋白量30 μg行SDSPAGE电泳分离及转膜，Ⅰ抗工作效价为1∶500，ECL化学发光法显影，Quantity One图像分析系统进行显影条带灰度值分析。

3 统计学处理

结 果

1 Pull－down检测TNF－α对bEnd.3细胞RhoA活性的影响

与对照组相比，bEnd.3细胞RhoA活性在TNF－α处理10 min无明显变化;30 min明显增高达到高峰(P＜0.01)，60 min稍下降但仍高于对照组(P＜0.05)，见图1。

Figure 1.Activation of RhoA by TNF－α.The bEnd.3 cells were incubated in the presence of TNF － α (10 μg/L)for the indicated time.A:RhoA activation was determined by pull－down assay.The RhoA －GTP pulled down from lysates was detected by Western blotting using a specific anti－RhoA antibody.The total amount of RhoA in cell lysates was used as a control for the comparison of RhoA activity.B:quantitation of pulldown experiments.±s.n=3.*P＜0.05.＊＊P＜0.01 vs control.图1 Pull－down检测TNF－α对bEnd.3细胞RhoA活性的影响

2 Western blotting检测TNF－α对bEnd.3细胞RhoA蛋白表达的影响

RhoA总蛋白表达在TNF－α刺激12和24h上调，与对照组之间的差异显著(P＜0.05)，见图2。

Figure 2.Time－course changes in the upregulation of RhoA protein induced by TNF － α (10 μg/L).The bEnd.3 cells were incubated in the presence of TNF－α(10 μg/L)for the indicated time points.A:total proteins were assayed for RhoA by Western blotting.The β －actin in cell lysates was used as a control.B:the expression levels of RhoA were summarized.±s.n=3.*P ＜0.05 vs control.图2 TNF－α对bEnd.3细胞RhoA蛋白表达量的影响

3 Western blotting鉴 定 siRNA 对 bEnd.3细 胞p115RhoGEF表达的抑制效果

与对照组相比，转染 p115RhoGEF siRNA的细胞p115RhoGEF的表达明显减少(P＜0.01)，分析显示其蛋白条带灰度值较对照组降低约91%，见图3。

Figure 3.Suppression of endogenous p115RhoGEF protein by siRNA.A:the bEnd.3 cells were transiently transfected with active siRNA against p115RhoGEF(siRNA)or the non－silencing RNA(nsRNA)and the protein lysates prepared at 72 h.Total proteins were assayed for p115RhoGEF by Western blotting.The β－ actin in cell lysates was used as a control.B:the expression levels of p115RhoGEF were summarized.±s.n=3.＊＊P ＜0.01 vs nsRNA.图3 siRNA对p115RhoGEF蛋白表达的影响

4 Pull－down检测p115RhoGEF siRNA对TNF－α刺激后RhoA活性改变的影响

TNF－α作用30 min后p115RhoGEF siRNA组RhoA有部分活化，但较对照组明显降低(P＜0.05)，分析显示其蛋白条带灰度值较对照组降低约51%，见图4。

Figure 4.Effect of p115RhoGEF siRNA on TNF－α stimulated RhoA activation.A:p115RhoGEF siRNA or nsRNA were transfected into bEnd.3 cells and TNF － α －stimulated RhoA activation was measured by pulldown assay;B:quantitation of pull－down experiments.±s.n=3.*P＜0.05 vs nsRNA.图4 p115RhoGEF siRNA对TNF－α刺激后RhoA活性改变的影响

讨 论

TNF－α是介导炎症、感染和其它内环境改变的重要起始因子，可直接损伤内皮细胞，导致应力纤维形成和细胞收缩。小G蛋白的Rho家族，由Rho、Rac和Cdc42三个亚家族组成，是一类能结合GTP的蛋白质，并能通过其下游效应蛋白介导多种生物功能包括细胞骨架形成、黏附、增殖和转录。近年研究表明，多种炎症介质和细胞因子均能激活Rho/Rho激酶途径，使肌球蛋白轻链磷酸化、肌动－肌球蛋白交联增加、F－actin骨架重组和应力纤维生成，导致内皮细胞收缩［5］;Rho激酶抑制剂Y－27632可以抑制肿瘤细胞游走过程中引起的血管內皮单细胞层电阻下降［6］。为探讨TNF－α对脑微血管内皮细胞RhoA的调控，本实验观察了TNF－α处理bEn.d3细胞后RhoA的活性和表达变化，证实TNF－α(10 μg/L)诱导RhoA活性增高，RhoA－GTP表达在刺激后30min和60min明显增加，30min达到高峰，同时，总RhoA蛋白在TNF－α刺激后12 h和24 h上调，与在支气管平滑肌细胞的研究结果一致［7］。我们的结果表明RhoA参与了TNF－α介导脑微血管内皮细胞内信号传递过程，RhoA的活性和表达增加可能是TNF－α损伤内皮细胞屏障功能的机制之一。

然而，TNF－α激活RhoA的具体机制仍不明确。RhoA的活化依赖GEFs催化GDP向GTP转化，说明GEFs在RhoA活化的信号转导中发挥关键作用。p115RhoGEF是1996年由Hart等［8］发现的特异活化RhoA的GEF;G蛋白α亚单位12/13(Gα12/13)转导激动剂(如凝血酶和溶血凝脂酸)的信号，通过提高p115RhoGEF的GEF活性来激活RhoA。同时，Holinstat等［9］在外周血管内皮细胞的研究中，发现凝血酶诱导的RhoA活化和随之的细胞骨架重组需要Gα12/13与蛋白激酶Cα(PKCα)共同对p115RhoGEF的激活。上述研究提示p115RhoGEF参与了外界刺激对RhoA活化的调控，而TNF－α活化RhoA是否受p115RhoGEF调控尚未见报道。我们使用RNA干扰技术成功抑制了p115RhoGEF表达，在此基础上予TNF－α刺激，30 min后RhoA活化较对照组明显降低，提示抑制p115RhoGEF可以部分阻止TNF－α对RhoA的激活，证实p115RhoGEF参与了TNF－α对RhoA活化的调控。

综上所述，TNF－α可以诱导小鼠脑微血管内皮细胞RhoA活性增加和表达上调，在一定程度上揭示了TNF－α损伤内皮细胞的机制。

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