朱祥松,张 俊
1.鄂州市食品药品监督检验所,湖北鄂州 436000;2.鄂州市中心医院康复科,湖北鄂州 436000
元明丹系由马钱子、三七、西红花、血竭、当归等多味中药组成的医院传统验方制剂,具有活血祛瘀、消肿化瘤、解毒止痛的功效,用于白血病、肉瘤癌、筋骨疼痛及风湿性关节炎等症。马钱子中所含的士的宁既为有效成分又具有毒性,安全范围窄,过量使用常会导致严重的神经系统不良反应[1],应严格控制其用量。本制剂的质量标准对士的宁仅有薄层色谱定性鉴别,为保证用药安全和制剂质量,本文采用RP-HPLC法对元明丹中士的宁进行定量分析,方法灵敏、简便、准确,可用于元明丹的质量控制。
DIONEX Ultimate3000高效液相色谱仪:LPG3400A泵,VDW3100紫外检测器,Chromeleon色谱工作站;BS21S电子天平(北京赛多利斯天平有限公司);Aquapro纯水仪(重庆颐洋企业发展有限公司)。
士的宁对照品 (中国药品生物制品检定所,批号110705-200005);元明丹(鄂州市某医院提供,批号为090201,090401, 090411);甲醇、乙腈为色谱纯;水为超纯水;其余试剂均为分析纯。
色谱柱为 DIONEX C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);乙腈-0.3%三乙胺溶液(磷酸调 pH=2.6)(9∶91)为流动相,流速:1.0 ml/min,柱温:30℃,检测波长:254 nm;进样体积:20 μl。理论塔板数按士的宁峰计算不少于5 000。
2.2.1 对照品溶液 称取士的宁对照品10.14 mg,置20 ml量瓶中,加三氯甲烷使溶解并稀释至刻度,摇匀,作为对照品储备液。精密量取对照品储备液3 ml,置25 ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,即得
2.2.2 供试品溶液 取元明丹适量,粉碎,过二号筛,取粉末0.7 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加氢氧化钠试液3 ml,混匀,放置30 min,精密加三氯甲烷20 ml,密塞,称定重量,置水浴中回流提取2.5 h,放冷,再称定重量,用三氯甲烷补足减失的重量,摇匀,分取三氯甲烷提取液,用铺有少量无水硫酸钠的滤纸滤过,弃去初滤液,精密量取续滤液5 ml,置60℃水浴挥干,残渣用甲醇溶解定容至5.00 ml,摇匀,用微孔滤膜(0.45 μm)滤过,即得。
2.2.3 阴性对照溶液 按处方比例制备不含马钱子的阴性对照样品,按照“2.2.2”项下方法制备阴性对照溶液。
分别吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各20 μl,注入色谱仪,同法测定,结果供试品溶液与对照品溶液主峰的保留时间一致,士的宁峰与其他峰完全分离,峰形理想,阴性对照无干扰。见图1。
精密量取对照品储备液5 ml,置25 ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,得对照品溶液⑤;精密量取对照品溶液⑤1、2、3、4 ml, 分别置 5 ml量瓶中, 加甲醇稀释至刻度,摇匀,分别作为对照品溶液①、②、③、④。将对照品溶液①~⑤用微孔滤膜(0.45 μm)过滤,依次进样 20 μl,测定峰面积。 以士的宁的峰面积(Y),分别对其进样量(X)进行线性回归,得回归方程为:Y=33.226 1X+11.139 5(r=0.999 7)。 结果表明,士的宁在0.405 6~2.028 μg与峰面积线性关系良好。
取对照品溶液,连续重复进样6次,每次20 μl,测定士的宁峰面积,RSD 为 0.96%(n=6)。
取批号为090401供试品6份,分别制备成供试品溶液,依法测定,计算含量。士的宁平均含量为1.63 mg/g,RSD为1.9%(n=6)。
将供试品溶液常温放置, 分别于 0、2、4、6、8,10 h 进样20 μl,测定士的宁峰面积,RSD 为 1.5%(n=6)。 结果表明,供试品溶液在10 h内基本稳定。
精密量取对照品储备液5份,每份各1 ml,分置锥形瓶中,于60℃水浴上挥干;精密称取“2.6”项下的已测定含量的元明丹5份分别至锥形瓶中,每份约0.35 g,按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,进样20 μl,计算回收率,结果见表1。
表1 加样回收试验结果(n=5)
取本品,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,依法测定,记录峰面积,按外标法计算含量,结果见表2。
表2 元明丹中士的宁的测定结果(n=3)
提取士的宁常采用碱性三氯甲烷水浴回流的方法[2,4],比较氢氧化钠试液和浓氨试液两种不同碱化试剂的提取效果,结果显示采用氢氧化钠试液效果较好;比较回流提取2.0、2.5、3.0 h,发现回流2.5 h已提取完全。
采用文献[4-8]报道的乙腈-0.01mol/L庚烷磺酸钠与0.02 mol/L磷酸二氢钾等量混合溶液 (用10%磷酸调节pH值为2.8)组成流动相时,发现士的宁峰与相邻峰不易分离。采用本文流动相时,利用三乙胺调节峰形,加入磷酸改善基线漂移现象,此时,样品中士的宁峰与其他峰完全分离,峰形较好。
[1]马密霞,胡文祥,刘接卿,等.马钱子属植物的药理毒理作用及临床应用进展[J].中国医院药学杂志,2007,(12):1725-1728.
[2]国家药典委员会.中国药典 [S].一部.北京:化学工业出版社,2005:34.
[3]杨春静,郜娜,姬广山.RP-HPLC法测定强筋健骨片中马钱子碱和士的宁的含量[J].中国药师,2010,13(4):519-520.
[4]宋玉国,彭振宇,张新茹.HPLC法测定风湿福音丸中马钱子碱、士的宁的含量 [J].中国药事,2010,24(5):507-513.
[5]丁红仙.高效液相色谱法测定十三味马钱子丸士的宁的含量[J].浙江中医药大学学报,2009,33(3):425-426.
[6]王歆君,刘进疆,王芳,等.胃尔康片质量标准的研究[J].西北药学杂志,2009,24(6):451-452.
[7]冯益民.高效液相色谱法测定平消片中士的宁含量 [J].中国药业,2009,18(12):50.
[8]闰雪生,朱建伟,江波,等.马钱子与甘草配伍前后士的宁和马钱子碱的HPLC 分析[J].亚太传统医药,2009,5(10):18-19.