安寐汤对失眠大鼠脑组织多巴胺含量的影响

刁远明，陈 群

广州中医药大学，广东广州 510006

失眠是睡眠障碍性疾病中最常见的症状，属中医“不寐”范畴，在临床上极为常见，指经常不能获得正常的睡眠，轻者入眠困难，或眠而不安酣，时寐时醒，醒后不能再入睡，严重者可整夜不眠，可反复数年不愈，给患者的身心健康带来了严重影响[1]。安寐汤为广州中医药大学陈群教授多年临床实践总结的经验方，具有宁神安寐、诱导睡眠的作用，临床应用效果显著。运用安寐汤治疗失眠患者126例结果显示总有效率为91.27%[2]。本文通过库仑阵列电化学高效液相色谱法检测安寐汤对失眠大鼠脑组织内单胺类中枢神经递质多巴胺（DA）含量的影响，探讨其宁神安寐，诱导睡眠的作用机制，为安寐汤进一步开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级SD大鼠，雌雄各半，体质量180～220 g，由广州中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（粤）2008-0020。正常光照，自由饮水、摄食，适应性喂养一周后，称重，随机化分为正常组、模型组、安寐汤低剂量组、安寐汤中剂量组、安寐汤高剂量组、安定对照组，每组12只，雌雄各半。

1.1.2 实验仪器与试剂

1.1.2.1 仪器 ESA 5600A库仑阵列电化学高效液相色谱仪（美国ESA公司），Coularray Win工作站，Heraeus Thurmo D-37520型高速冷冻离心机（德国Heraeus公司），Dionex Tcc-100型柱温箱（美国戴安公司），pHS-25型pH计（上海精密科学仪器有限公司），GenPure超纯水系统（德国TKA公司），BP211D电子天平（德国Sartorious），3K超滤管（PALL公司）。

1.1.2.2 试剂 DA标准品（批号：100076-200405）为中国药品生物制品检定所产品；对氯苯丙氨酸（PCPA）为sigma公司产品，批号：C6506；安定由广州中医药大学第一附属医院药房提供；乙腈为色谱纯（德国默克公司）；实验用其他试剂均为分析纯。

1.1.3 药物制备及给药方法

1.1.3.1 药物制备 安寐汤组成分：夜交藤、酸枣仁、生龙骨、珍珠母、五味子、白芍、生地等。实验所用中药饮片均购自广州市药材公司，经验证为正品。安寐汤组成药物中的生龙骨、珍珠母先煎1 h，再与方中其他药物一起煎煮2次，10倍量水，每次1 h，过滤，合并滤液，水浴浓缩成1∶1药液，置冰箱内4℃保存备用。安定片研碎配成相应浓度的混悬液备用。

1.1.3.2 给药方法 除正常组大鼠外，其余各组大鼠腹腔注射对氯苯丙氨酸（PCPA）300 mg/kg，临用前用弱碱性生理盐水配置成混悬液，连续注射2 d。造模同时开始灌胃，各受试药物的灌胃剂量以人体推荐量为依据，灌胃量为1 ml/100 g，每日1次。以等效剂量为中剂量，低剂量为等效剂量的1/2，高剂量为等效剂量的2倍给药，正常组、模型组给予等体积生理盐水，连续给药10 d。

1.2 方法

1.2.1 检测样品制备

方法[3-6]，实验大鼠连续给药10 d后，禁食12 h，断头处死动物，在冰台上迅速分离出大脑组织，将标本称质量后，锡纸包好，保存于-80℃冰箱中。称取脑组织0.3 g，加入1 ml 0.1 mol/L高氯酸溶液冰浴匀浆，用涡旋器混匀，4℃离心10 min，转速15 000 r/min，取上清液置于3 K超滤管中4℃离心10 min，转速12 000 r/min，取超滤后上清液检测。

1.2.2 色谱条件

色谱柱为 Luna C18色谱柱（Phenomenex，4.6 mm×150 mm，5 μm），Alltech C18预柱（Alltima，7.5 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为缓冲液（每升水含EDTA 37.2 g，NaH2PO431.2 g，辛烷磺酸钠 1 g，pH=4.0）∶乙腈=87∶13；流速为 1.0 ml/min；检测电压为350 mV；柱温为 35℃；自动进样器温度为 4℃；进样量 15.0 μl。

1.3 统计学处理

含量计算公式：含量（μg/g湿组织）=CV/W，式中C为大鼠脑组织样品测得的浓度（μg/ml），V为样品预处理过程中加入液体体积总量（ml），W为脑组织湿重（g）。统计采用SPSS 12.0软件分析，数据以均数±标准差（±s）表示，总体比较采用方差分析，组间比较采用方差分析LSD进行两两比较，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

各组DA含量结果见表1。大鼠第一次腹腔注射PCPA造模后28～30 h开始出现昼夜节律消失，白天也活动不停，烦躁不安，易激惹和攻击性增强等表现，表明失眠大鼠造模成功。脑组织DA含量检测结果显示，模型组大鼠脑组织中DA含量与正常组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。安寐汤高、中剂量组大鼠脑组织中DA含量与模型组相比显著降低（P＜0.05），安寐汤低剂量组大鼠脑组织中DA含量与模型组相比有所降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）。安定对照组大鼠脑内DA含量与模型组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各实验组大鼠脑内DA含量

3 讨论

失眠， 中医又称为 “不寐”、“不得眠”、“不得卧”、“目不瞑”等，是以经常不能获得正常睡眠为特征的一类病症。目前，影响人们身心健康、生活质量和工作效率的第一问题是失眠，预计到2020年全球有大约超过7亿失眠者。

安寐汤方中生龙骨、珍珠母含钙、铁、钠、钾等微量元素，可抑制神经与骨骼肌兴奋，作用于快波睡眠期，对失眠伴有多梦、惊悸、遗精、盗汗效果较好。五味子含五味子素、五仁醇，与白芍均对中枢神经系统有抑制、镇静作用。夜交藤药性平和，功擅引阳入阴，据现代药理研究[7]，在诸多安神药中，以夜交藤诱导睡眠、缩短入睡潜伏期的作用最好，并有明显的安定作用，可用于各类失眠。酸枣仁对实验动物和人均有显著而温和的催眠、镇静、安定效果，为治疗虚烦不得眠的要药。酸枣仁与夜交藤两药，为无论古代医家还是现代中医治疗失眠使用最多的药物，也是安寐汤的君药。

安寐汤以化石、介壳类安神药生龙骨、珍珠母潜阳入阴、重镇安神；以植物类安神药夜交藤、酸枣仁、五味子、白芍、生地黄养心安神，诱导睡眠，辨证加减用于治疗不寐症，取得了较好的临床疗效。该方药味精炼，组方巧妙合理，治标当中兼顾治本。现代药理及临床实验研究结果也显示，本类药物可作用于中枢神经系统，起镇静、催眠作用，或改善中枢神经系统功能，且无毒副作用、耐药性和药物依赖性，是治疗失眠具有开发前景的理想药物。

研究表明，睡眠发生不仅是生物体对环境变化的被动反应，更是中枢神经系统内发生的一个主动过程，当与睡眠-觉醒机制相关的中枢神经递质含量发生改变时，机体会表现出明显的睡眠障碍。有实验报道，中脑腹侧被盖区（VTA）存在大量的多巴胺神经元，其纤维投射到纹状体、边缘系统、大脑皮质外，还与视前区、蓝斑、中缝核等与睡眠一觉醒有关的神经结构有着广泛的联系，当脑内DA浓度增高时，脑电出现低幅快波，即兴奋的表现[8]。

安寐汤是临床行之有效的治疗失眠的方剂，作者前期研究中也证实安寐汤高中低剂量组均有显著的促睡眠作用，能显著提高小鼠入睡率，缩短入睡时间，延长睡眠时间，但其作用机制尚不明确。从本研究来看，大鼠注射PCPA造模后脑内DA含量显著升高，与文献[8]报道一致，经灌胃给药10 d后，安寐汤中、高剂量组用药后DA含量显著下降，与模型组比较差异有统计学意义。安寐汤低剂量组用药后DA含量与模型组比较有所降低，但差异无统计学意义，可能与其剂量较低未能明显起效有关。安定对照组大鼠脑内DA含量与模型组相比差异无统计学意义，说明安定镇静催眠作用的发挥主要不是通过DA含量变化起作用的。DA在脑内主要起兴奋作用，对睡眠具抑制作用，安寐汤中、高剂量组可使失眠大鼠脑内升高的DA含量降低，从而使大脑兴奋性降低，由此认为安寐汤促睡眠机制与其可以调节大鼠脑内DA的含量密切相关，其促睡眠机制是否与其他中枢神经递质有关系有待进一步深入研究。

[参考文献]

[1]杨德富.中医药治疗失眠的现状[J].光明中医,2009,24(9)：1818-1819.

[2]陈群,徐志伟.安寐汤治疗失眠126例疗效观察[J].新中医,2000,32(6)：18-19.

[3]张潇.高效液相色谱-电化学法测定大鼠不同脑区单胺类神经递质及其代谢产物的方法学研究[J].辽宁中医药大学学报,2009,11(6)：255-257.

[4]张峰,曹仲伟,李法曾.黄芪对应激大鼠生长和脑单胺类神经递质含量的影响[J].山东大学学报：医学版,2008,45(7)：645-649.

[5]谢忠礼,李杰,王兴华.加味四逆散对慢性应激模型大鼠下丘脑单胺类神经递质的影响[J].中国实验方剂学杂志,2008,14(1)：50-52.

[6]吴勇,李政木,卓廉佳,等.肾气丸“阴中求阳”配伍对肾阳虚大鼠下丘脑多巴胺及五羟色胺含量的影响[J].时珍国医国药,2009,20(10)：2387-2388.

[7]骆和生,王建华.中药方剂的药理与临床研究进展[M].广州：华南理工大学出版社,1991：267.

[8]刘彬,臧佩林.保神开郁冲剂影响失眠鼠中枢递质的实验研究[J].辽宁中医杂志,2000,27(2)：92-94.