脑脊液中检测DLL1对结核性脑膜炎的诊断意义

沈 萍 鲁晶晶 李尽义 彭 涛 贾延劼△

1)河南新郑市人民医院神经内科 新郑 451100 2)郑州大学第一附属医院神经内科 郑州 450052

脑脊液中检测DLL1对结核性脑膜炎的诊断意义

沈 萍1)鲁晶晶2)李尽义2)彭 涛2)贾延劼2)△

1)河南新郑市人民医院神经内科 新郑 451100 2)郑州大学第一附属医院神经内科 郑州 450052

目的探索脑脊液(CSF)中Delta-like-1(DLL1)的检测在结核性脑膜炎诊断中的临床价值。方法选择诊断明确的中枢神经系统感染性疾病患者50例,分为结核性脑膜炎(结脑组)30例,病毒性脑(膜)炎(病脑组)20例,以及正常对照组20例,颅内转移瘤(肿瘤组)8例。采用酶联免疫吸附试验定量测定患者CSF中DLL1的含量。结果各组CSF中DLL1的含量,结脑组显著高于其他组别,差异均有统计学意义(P＜0.01),其他组别之间相比差异均无统计学意义(P＞0.05)。各组CSF中DLL1的含量与CSF蛋白、细胞数、葡萄糖、氯化物及颅内压均无相关性。结论DLL1检测作为一种新的指标,在结核性脑膜炎的诊断中可能有重要临床价值。

Delta-like-1;结核性脑膜炎;脑脊液

近年来,由于耐药结核菌株增加、人口流动及获得性免疫缺陷综合征流行等因素,结核性脑膜炎(tuberculousmeningitis,TBM)发病率明显上升,成为威胁人类生命的主要肺外结核病。对结核性脑膜炎患者进行早期诊断,及时治疗,是挽救生命,减少后遗症的关键[1]。鉴于临床工作中结核性脑膜炎不典型病例增多,常规的实验方法敏感性低等状况,寻找一种简单易行有助于临床诊断的生物标记物显得尤为重要。脂肪酸代谢是结核分枝杆菌(mycobacterium tubercu-losis)存活的重要碳源。近年来研究发现,脂肪酸代谢还与结核分枝杆菌的毒力和逃逸免疫系统攻击的能力息息相关[2]。基于这种理论,本研究选择了一个参与脂肪代谢调节的指标——Delta-Like-1(DLL1)[3],采用酶联免疫吸附试验(ELISA法)定量测定中枢神经系统感染性疾病患者CSF中DLL1的含量,探讨DLL1检测在结核性脑膜炎诊断中的意义。

1 资料和方法

1.1 研究对象 选取2007-09～2010-09入住新郑市人民医院和郑州大学第一附属医院神经内科及儿科的中枢神经系统感染性疾病患者50例,均严格按照相关标准确诊。结核性脑膜炎患者30例为结脑组,男10例,女20例,年龄7～49岁,平均(19.2±14.0)岁;病毒性脑(膜)炎患者20例为病脑组,男12例,女8例,年龄6～ 53岁,平均(15.9±11.8)岁;正常对照组选择无中枢神经系统感染、肿瘤、免疫性疾病、血液系统疾病而需要鉴别诊断的周围神经病变或头痛等患者20例,男 13例,女 7例,年龄 4～ 60岁,平均(22.2±17.4)岁。同时选择颅内转移瘤8例为肿瘤组,男6例,女2例,年龄 39～70岁,平均(55.3±7.4)岁。

1.2 诊断标准 (1)年龄＞12周岁的24例患者按照Ahuja等[4]的TMB诊断标准(Ahuja标准)。(2)年龄≤12周岁的6例患者参照有 Seth和 Sharma[5]的标准(Seth标准)。

1.3 研究方法

1.3.1 标本采集：在获得患者或其家属知情同意的情况下,行腰穿取脑脊液2 m L。所有标本登记后,均放入-20℃冰箱保存。

1.3.2 DLL1的测定：采用酶联免疫吸附试验(ELISA法),试剂盒由韩国AdipoGen公司提供,货号：AG-45A-0027EKKI01,严格按照说明书操作。(1)准备好试剂及样品后,从密封的铝箔袋取出适当数量的微孔条。(2)吸100μL标准样品(#0～#7),重组质量控制样品和稀释的样品加入抗体涂层板,每次换个新的吸头。(3)37℃孵育1 h。(4)弃去溶液,对每口孔用300μL洗涤液冲洗3次。(5)向每口孔添加100 μL二抗。(6)37℃孵育1 h。(7)弃去溶液,用300μL洗涤液冲洗3次。(8)向每口孔添加100μL显色底物。(9)37℃孵育1 h。(10)弃去溶液,用 300μL洗涤液冲洗5次。(11)加入100μL显色液至每口孔。(12)避光下在室温下孵育20 min。(13)向每口孔添加100μL终止液。(14)在 450 nm 处读取。(15)减去从每个标准和样品吸光度阅读空白。(16)构建一个通过绘制已知浓度(浓度)(Y)与吸光度(吸光率)(X)的标准曲线。图1示,一个可衡量的范围通常为(标准曲线)0.125～8 ng/m L。(17)通过回归曲线插值公式,计算样品的可溶性DLL1浓度,如下所示的一个二次方程公式：Y=8.973X2+5.7289X-0.0474;R2=0.9996。(18)DLL1浓度计算乘以稀释倍数,以获得该样品稀释前的浓度。

检测CSF常规、生化、细胞学、病毒学、腺苷脱氨酶、抗结核抗体、抗酸染色、墨汁染色、肿瘤标记物、细菌培养等相关指标。

1.4 统计学方法 所有数据均采用SPSS 13.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示。多组间比较用方差分析(F检验)或K ruskal-Wallis检验,组间两两比较用LSD-t检验、Bonferroni法或 Tamhane's T2法;2组间比较用t检验或W ilcoxon秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CSF中DLL1的含量测定 表1示,结脑组、病脑组、对照组、肿瘤组CSF中DLL1的含量(ng/m L)分别为3.41±3.04、0.23±0.26、0.22±0.22、0.37±0.37,结脑组与病脑组、对照组、肿瘤组相比均有极显著性差异(F=18.217,P=0.000＜0.01),病脑组、肿瘤组与对照组相比均无显著性差异(F=1.045,P=0.132＞0.05)。

表1 各组CSF中DLL1的含量比较 (±s)

表1 各组CSF中DLL1的含量比较 (±s)

注：P值为结脑与其他组别相比

组别 n DLL1(ng/m L)DLL1＞1.0 ng/m L[例(%)]P值结脑组 30 3.41±3.04 26(86.7)病脑组 20 0.23±0.26 0 0.000对照组 20 0.22±0.22 0 0.000肿瘤组 8 0.37±0.37 1(12.5) 0.000

2.2 DLL1的含量与CSF中蛋白、细胞数、葡萄糖、氯化物及颅内压的相关性 CSF中DLL1的含量与蛋白含量、细胞数、葡萄糖、氯化物及颅内压均无相关性。

3 讨论

结核性脑膜炎病人的临床表现渐趋于不典型,以至于临床诊断不明确而延误病情。传统的涂片抗酸染色敏感率低;结核分支杆菌培养不但敏感率低,耗时也长;聚合酶链反应技术不断改进,敏感度和特异度可达87.6%和92.0%[6],但技术条件要求越来越高。确诊困难、误诊率和漏诊率高是当前我国结核性脑膜炎的临床现状。应用免疫学方法检测脑脊液中的特异性生物标记,有望弥补上述方法的种种缺陷。

基因组分析可知,结核分枝杆菌基因组含4000多个基因,其中有250个基因编码脂肪酸代谢相关的酶,和大肠杆菌相比多了4倍有余。结核杆菌的细胞壁以肽聚糖为基本架构,共价结合阿拉伯半乳糖及分支菌酸。分支菌酸是自然界中最大的脂肪酸,它和结核杆菌的毒力、结核杆菌逃逸免疫系统攻击的能力息息相关;另外,细胞壁所含的脂类约占细胞壁干质量的60%,这些证据均说明了脂肪代谢对结核杆菌的重要性[2]。

DLL1是果蝇Notch的5种配体之一,是737个氨基酸组成的L型跨膜蛋白,其胞外段中有1个DSL基序和8个EGF样结构域;Notch配体与受体的相互作用通过信号转导,精确地调控各谱系细胞的分化,决定细胞的命运,对细胞的增殖和凋亡也有广泛的调控作用[3]。研究报道,Notch1信号可以通过调控脂肪酸活化的转录因子影响脂肪细胞的形成,在脂肪代谢中起到重要作用[7]。结核病是一种慢性消耗性疾病,存在脂肪代谢的紊乱,导致脂肪细胞过度分化;Notch配体DLL1的加速脱落可能有助于Notch信号促进脂肪细胞的分化。因此,本研究采用ELISA法定量测定中枢神经系统感染性疾病患者CSF中DLL1的含量,寻求新的结核性脑膜炎诊断方法。

结果表明,结核性脑膜炎组中CSF的DLL1含量明显高于其他组别,30例测定值中26例(86.7%)＞1.0 ng/m L,而病脑和正常对照组无1例＞1.0 ng/m L,以大于该值为判断值,就可以很好地与病脑及正常人区别开来,且 CSF中DLL1的含量与CSF中蛋白、细胞数、葡萄糖、氯化物及颅内压均无相关性,对不典型病例有更大的诊断价值。这种现象的机制尚不完全清楚,除了与前述的DLL1过多脱落有助于Notch信号促进脂肪细胞的分化有关之外,还可能涉及如下的机制：(1)当结核菌侵入中枢神经系统后引起结核性脑膜炎时,因局部的免疫反应,使T淋巴细胞数量明显增多、增殖、分化,T淋巴细胞释放出炎性因子、淋巴细胞毒素等,从而出现渗出、炎症;T淋巴细胞增多需要Notch信号途径的激活,Kapoor等发现在结核性脑膜炎患者脑内结核性肉芽肿中Notch1信号途径的激活。Notch信号通路在造血干细胞向T细胞分化过程中至关重要,如果缺少Notch受体蛋白,胸腺中的淋巴祖细胞只发育成B细胞,无T细胞的产生[8],在外周Notch信号途径的激活可以使淋巴样前体细胞向T细胞谱系而不向B细胞谱系发育;细胞亚群中ADAM介导的DLL1脱落,似乎有助于Notch信号在邻近细胞的下调,并促进淋巴祖细胞的分化进程,促进T细胞的产生。(2)DLL1通过支架蛋白MAGI1,位于神经细胞突起的黏附连接(adherens junctions,AJs)里,当结核性脑膜炎导致的神经细胞黏附连接损伤后,DLL1可能释放出来,从而使得DLL1的含量增高[9]。

综上所述,结核性脑膜炎患者CSF中DLL1含量明显增高,而病脑与正常对照组CSF中DLL1的含量很低或基本测不到;颅内肿瘤组CSF中DLL1的含量偏低。检测CSF中DLL1的含量对于结核性脑膜炎的诊断和鉴别诊断具有重要参考意义。

[1]Vinnard C,M acg regor RR.Tuberculousmeningitis in H IV-infected individuals[J].Cu rr HIV/AIDSRep,2009,6：139-145.[2]Carballeira NM.New advan ces in fatty acids as antimalarial,antimycobacterial and antifungal agents[J].Prog Lipid Res,2008,47：50-61.

[3]Murata A,Okuyama K,Sakano S,et al.A Notch ligand,Delta-like 1 functions as an adhesion molecule for mast cells[J].J Immunol,2010,185：3 905-3 912.

[4]Ahuja GK,M ohan KK,Prasad K,et al.Diagnostic criteria for tuberculousm eningitis and their validation[J].Tuber Lung Dis,1994,75：149-152.

[5]Seth R,Sharm a U.Diagnostic criteria for tuberculousm eningitis[J].Indian JPediatr,2002,69：299-303.

[6]全超,乔健,肖保国,等.酶联免疫斑点法和IS6110聚合酶链反应在早期诊断结核性脑膜炎中的价值[J].中华神经科杂志,2008,41：176-179.

[7]Garcés C,Ruiz-Hidalgo MJ,Font de Mora J,et al.Notch-1 controls the expression of fatty acid-activated transcription factors and is required for adipogenesis[J].JBiol Chem,1997,272：29 729-29 734.

[8]Visan I,Yuan JS,Tan JB,etal.Regulation of intrathym ic T-cell developmen t by Lunatic Fringe-Notch1 in teractions[J].Immunol Rev,2006,209：76-94.

[9]M izuhara E,Nakatani T,M inaki Y,et al.MAGI1 recruits D ll1 to cadherin-based adherens junctions and stabilizes it on the cell su rface[J].JBiol Chem,2005,280：26 499-26 507.

Significance of detecting DLL1 in cerebrospinal fluid on diagnosing tuberculousmeningitis

Shen Ping,Lu Jing jing,Li Jinyi,eta l.Departmentof Neurolog y,the Peop le's Hospita l of X inzheng City,X inzheng451100,China

ObjectiveTo investigate clinical value ofmeasurementof the cerebrospinal fluid DLL1 in diagnosis of tuberculousmeningitis.MethodsFifty patientswith central nervous system in fects of exp licit diagnosisw ere divided into two groups,group TM included 30 tuberculousmeningitis sick patients,group VM included 20 viralmeningitis cases,compared w ith 20 controls with no central nervous system infection,and group IMT included 8 intracranialmetastatic tumors patients.So luble DLL1 in CSF of these patientsw ere synchronal detected by ELISA.ResultsThe levels of CSF solub le DLL1 in TM wereobviously higher than those of VM and controlgroup and IM T(3.41±3.04 vs 0.23±0.26,0.22±0.22,0.37±0.37,P＜0.01),there were no significant differences among VM,PM,IM T and controls(P＞0.05).The levels of CSF so lub le DLL1 w ere not relevantw ith CSF protein,CSF cell count,CSF g lucose,CSF ch loride and intrac ranial p ressure in all the groups.ConclusionMeasurement of soluble DLL1 as a novel indication,possibly has potential important clinical value in the tubercularmeningitis diagnosis.

DLL1;Tuberculousmeningitis;Cerebrospinal fluid

R529.3

A

1673-5110(2011)09-0014-03

△通讯作者：贾延劼,E-mail：jiayanjie1971@yahoo.com.cn

(收稿2011-03-26)