紫外分光光度法测定生鲜乳中动物水解蛋白L－羟脯氨酸含量

孔晓锋 古丽曼 达成彪 帕提曼

紫外分光光度法测定生鲜乳中动物水解蛋白L－羟脯氨酸含量

孔晓锋 古丽曼 达成彪 帕提曼

采用紫外分光光度法测定生鲜乳中动物水解蛋白L-羟脯氨酸含量，结果表明，L-羟脯氨酸在 0.00～1.11 μg/ml范围内具有良好的线性关系（r=0.999 0）,在 100～300 μg/ml范围内平均回收率为98.7%，RSD=6.3%，因此，该法可用于生鲜乳中动物水解蛋白的鉴定，即L-羟脯氨酸的测定。

紫外分光光度法；动物水解蛋白；L-羟脯氨酸

皮革水解物是皮革“鞣革”工艺中产生的下脚料，是一种廉价的工艺原料，最常见的皮革水解物就是皮革粉。将其掺入牛奶或奶粉中可提高蛋白质的含量，会导致不易消化，吸收利用率降低，影响人体健康。检测牛奶中皮革水解物，实际就是检测牛奶中的L-羟脯氨酸。L-羟脯氨酸，英文名L-Hydroxy proline,trans-4-Hydroxy-L-proline,别名：L-4-羟脯氨酸、反-4-羟基-L-脯氨酸，分子式为C5H9NO3,分子量为131.13。它是人体所需氨基酸，是胶原蛋白（皮革水解蛋白）特有的氨基酸，占正常胶原蛋白氨基酸总量的10%以上，是衡量机体胶原含量的一个重要指标。牛奶中不含此氨基酸。检测原理是生鲜乳经过盐酸水解，释放出L-羟脯氨酸，经氯胺T氧化，生成含有吡咯环的氧化物，用高氯酸破坏过量的氯胺T，终止氧化，含有吡咯环的氧化物与对甲氨基苯甲醛生成红色化合物，在波长558 nm处进行比色测定。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

UV-2401紫外分光光度计[岛津仪器（苏州）有限公司]、NDO-400定温干燥箱（日本东京理化器械上海工厂）、BS 210S电子天平（北京赛多利斯公司）、DKS22型电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）、奥立龙868酸度计（美国ORION公司），实验室常规设备。

1.2 试剂

所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

1.2.1 氢氧化钠溶液

浓度为10 mol/l和1 mol/l。

1.2.2 缓冲溶液

将50 g柠檬酸、26.3 g氢氧化钠和146.1 g结晶乙酸钠溶于水，稀释至1 L，此溶液与200 ml水和300 ml正丙醇混合。

1.2.3 氯胺T溶液

将1.41 g氯胺T溶于10 ml水中，依次加入10 ml正丙醇和80 ml缓冲溶液。现用现配。

1.2.4 显色剂

称取10 g对二甲氨基苯甲醛，用35 ml高氯酸溶解，缓慢加入65 ml异丙醇。

1.2.5 L-羟脯氨酸标准溶液

1.2.5.1 L-羟脯氨酸标准储备液（500 μg/ml）

精密称取L-羟脯氨酸标准品50 mg，用少量0.02 mol/l盐酸溶解并定容至100 ml容量瓶。

1.2.5.2 L-羟脯氨酸标准工作液（5 μg/ml）

精密量取L-羟脯氨酸标准储备液1 ml，用少量0.02 mol/l盐酸溶解并定容至100 ml容量瓶。

2 方法与结果

2.1 样品前处理

称取5 g生鲜乳样品，精确至0.000 1 g,至20 ml水解管中，加入5.00 ml浓盐酸（优级纯），滴加3滴50 g/l苯酚水溶液（新蒸馏的苯酚），氮吹，在氮吹的状态下封口，在110℃水解24 h,取出冷却，同时做空白试验。打开水解管，用滤纸过滤到100 ml容量瓶中，用蒸馏水反复冲洗滤纸和漏斗，定容。吸取10.00 ml的水解液于烧杯中，使用10 mol/l和1 mol/l的氢氧化钠溶液调节pH值至8±0.2，用水定容至50 ml容量瓶，摇匀待测。

2.2 线性关系

2.2.1 吸取 L-羟脯氨酸标准工作液 （5 μg/ml）0、10.00、20.00、30.00、40.00 ml，分别置于 100 ml容量瓶中，定容摇匀，浓度分别为 0、0.5、1.0、1.5、2.0 μg/ml。

2.2.2 取上述不同浓度的溶液5.00 ml，分别加入50 ml纳氏比色管中，加入2.00 ml的氯胺T溶液（现用现配），摇匀后，室温静置20 min，再加入2.00 ml显色剂，摇匀，浓度分别为 0、0.28、0.56、0.83、1.11 μg/ml，60℃水浴20 min。

2.2.3 迅速冷却，在558 nm波长处测定吸光度，吸光度分别为 0.031、0.163、0.275、0.379、0.485A，以浓度 C为纵坐标，吸光度A为横坐标，进行回归分析，线性范围为 0～1.11 μg/ml，回归方程为 C=2.459A-0.100，r=0.999 0。

2.3 样品测定

取待测水解液5.00 ml，按照2.2.2、2.2.3进行测定。

2.4 分析结果的测定

式中：X——样品中L-羟脯氨酸的含量（g/100 g）；

C——从标准曲线上查得相应的L-羟脯氨酸量（μg/ml）；

m——试样的质量（g）。

当符合允许误差所规定的要求时，取两次测定结果的算数平均值作为结果，结果精确到0.01%。

同一分析者同时或相继进行的两次测定结果之差不得超过平均值的5%。

2.5 准确度试验

取6支20 ml水解管，每管均精密加入5 ml空白牛奶，取5 000 μg/ml L-羟脯氨酸标准储备液100、150、300 μl分别加入水解管中，制成 100、150、300 μg/ml浓度，按样品测定方法测定回收率，结果见表1，由表1可以看出，本方法在100～300 μg/ml范围内，其加标回收率在91.8%～106.8%之间，相对标准偏差为6.3%，满足用分光光度分析方法的试验要求。

表1 L-羟脯氨酸回收率（n=6）

2.6 精密度试验

取添加浓度为100 μg/ml样品，按样品测定方法重复测定6次，结果见表2。

表2 L-羟脯氨酸精密度试验

3 结论

该试验在生鲜乳中添加L-羟脯氨酸的浓度为100、150、300 μg/ml，测得 L-羟脯氨酸的回收率范围为91.8%～106.8%，平均回收率为98.7%，相对标准偏差为6.3%，方法的精密度试验结果好，能满足生鲜乳中动物水解蛋白的鉴定，即L-羟脯氨酸的测定。

4 注意环节

4.1 生鲜乳空白样品中含有一定量的L-羟脯氨酸，可能是由检测过程中使用的各种试剂引入，计算结果时要扣除空白。

4.2 试样水解需在充满氮气状态下旋紧水解管盖。

4.3 水解液过滤时不要漏液，使用蒸馏水,遵循少量多次原则，冲洗漏斗、滤纸。

4.4 试样前处理过程调节pH值，应先高浓度后低浓度，滴速不应过快，控制pH值在8±0.2。

4.5 前处理过程需多次稀释，注意稀释倍数。

Assaying L-Hydroxyproline of derived animal hydroprotein in raw milk by ultraviolet spectrophotometry

Kong Xiaofeng,Gu Liman,Da Chengbiao,Pa Timan

L-Hydroxyproline has good linear relationship in scope of 0.00～1.11 μg/ml by ultraviolet spectrophotometry with its correlation coefficient（r）of 0.999 0 and its averaged recovery is 98.7%in scope of 100～300 μg/ml,RSD=6.3%.The result testifyed that the method can assay L-Hydroxyproline of derived animal hydroprotein in raw milk.

ultraviolet spectrophotometry；derived animal hydroprotein；L-Hydroxyproline

S 816.17

A

1001-991X（2011）04-0060-02

孔晓锋，新疆兽药饲料监察所，830063，乌鲁木齐市南湖西路37号。

古丽曼、达成彪、帕提曼，单位及通讯地址同第一作者。

2010-10-08

（编辑：高 雁，snowyan78@163.com）