细菌内毒素试验常用定性与定量法的比较*

汤京义

(泰山医学院附属新泰医院，山东 新泰 271200)

内毒素是革兰氏阴性细菌细胞内的一种耐热脂多糖，它的污染性强，而且稳定。当内毒素污染血液制品、生物制品和药品后，如果应用可引起机体发冷发热，白细胞下降，血管通透性增加等“热原质反应”。长期以来国内外检测热原均采用家兔法。但是，家兔法常常因为动物个体差异而影响到实验结果，同时造成人力和物力浪费等。细菌内毒素能激活鲎试剂中的凝固酶原产生凝集反应形成凝胶。1985年我国卫生部批准将鲎试验法用于血液制品生产流程中控制内毒素污染。凝胶鲎试剂检测采血袋内毒素，具有特异性好、灵敏度高、简便等优点。因此，我院采用鲎试剂，利用凝胶法和动态浊度法，对采血用的一次性耗材——采血袋进行热原检测，对两种检测方法进行比较，现报道如下。

1 材料与方法

1.1凝胶法材料和试剂 血液保存液Ⅱ、红细胞添加剂，37℃水浴箱，漩涡振荡仪，无菌安瓶。鲎试剂灵敏度0.25 EU/ml，细菌内毒素工作标准品，无菌检测用水。

1.2动态浊度法材料和试剂 1ET-24A细菌内毒素检测仪(天津天大开发公司生产)。鲎试剂盒(湛江博康海洋生物有限公司生产)。

1.3方法

1.3.1凝胶法

1.3.1.1鲎试剂灵敏度复核 用细菌内毒素工作标准品，按照生物制品细菌内毒素试验操作规程2.1进行操作[2]。

1.3.1.2供试品干扰试验 用血液保存液Ⅱ，按照生物制品细菌内毒素试验操作规程2.2进行操作[2]。

1.3.1.3供试品内毒素检测 试验直接用0.1 ml试剂瓶进行操作，方法严格按照试剂说明书操作。

1.3.2动态浊度法

1.3.2.1标准曲线制作 首先将标准品溶解稀释成2.0 EU/ml、1.0 EU/ml、0.5 EU/ml、0.125 EU/ml，加样按照试剂说明书操作。加样完毕封口安瓶，将试管在漩涡仪上振荡1～3秒，将安瓶对应插入已经恒温(37℃)的定量检测仪，仪器自动采集数据。

1.3.2.2供试品干扰试验用回收率判断 按照所得线性回归方程分别计算供试品溶液和含标准内毒素的供试品的溶液的内毒素含量Ct和Cs,再按下式计算该试验条件下的回收率(R)：R=( Cs-Ct)/ λm×100%。当内毒素的回收率在50%～100%之间，则认为在此试验条件下供试品溶液不存在干扰作用。

1.3.2.3供试品内毒素检测 试验严格按照试剂盒说明加样，仪器使用严格按照ET-24A细菌内毒素检测仪使用说明进行。

2 结 果

2.1凝胶法

2.1.1凝胶法灵敏度复核结果 见表1。

表1 凝胶法灵敏度复核结果

注：λ=0.25 EU/ml，λc=lg-1[(0.5λ)+3(λ)]/4=0.214。当λc在0.5λ～2.0λ时方可用于细菌内毒素检查,并以λ为该批试剂的灵敏度。

2.1.2凝胶法干扰试验结果 见表2。供试品最大稀释倍数(MVD)按照下列公式计算：MVD=CL/λ=5.6/0.25=20倍，L为供试品的细菌内毒素限值，C为供试品浓度，当L以EU/ml 表示时C为1.0ml/ml。

表2 凝胶法干扰试验结果

注：Es在0.5λ～2.0λ，且Et在0.5 Es～2.0 Es，认为供试品在该浓度下无干扰作用。

细菌内毒素检查用水制成的内毒素标准的反应终点内毒素浓度的几何平均值为0.25λ≤ES≤2.0λ，且当MVD稀释的样品液制成的内毒素与标准液反应终点内毒素的几何平均值为0.25λ≤Et≤2.0λ时，则认为MVD下无干扰供试品检测结果判定;将安瓶从水浴箱轻轻取出，缓缓倒转180℃时，凝胶不变形，不从安瓶壁滑脱为阳性。凝胶不能保持完整并从壁滑脱为阴性。

2.3动态浊度法 标准曲线有效条件，当阴性对照的时间大于标准曲线最低浓度反应时间，将全部数据进行线性回归分析。根据线性回归分析，标准曲线的相关系数(r)的绝对值大于或等于0.98，试验有效(表3)。

表3 动态浊度法标准曲线结果分析

2.3.1标准曲线LgT=2.9783-0.2621LgC,相关系数r=0.999符合规定。

2.3.2干扰试验 以样品浓度C=1.0 ml/ml，稀释倍数20为例，计算该浓度下的回收率(R)：

R=( Cs-Ct)/ λm×100%=(0.502-0)/0.5×100%=100.40%

2.3.3供试品检测结果 仪器直接显示：试验有效条件(1)标准曲线要符合r值大于或等于0.98要求；(2)计算出的内毒素的回收率要在50%～200%的范围内；(3)阴性对照的反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间。符合以上三个条件后，若供试品溶液所有平行安瓶的平均内毒素浓度乘以稀释倍数后，小于规定的内毒素限值，判断供试品符合规定。若大于或等于规定的内毒素限值，判断供试品不符合规定。

3 讨 论

通过近1年的比较观察验，动态浊度法和凝胶法有不同点，比较见表4。

定量法的特点(1)通过反应曲线，直观显示鲎试剂的反应过程；通过反应曲线，考察样本中的干扰。(2)快速、准确测到样品中的内毒素含量，有利于原辅材料的质量控制；也可以作为原辅材料招标的依据；本设备软件还可以检测病人和血液中的内毒素含量，作为判断细菌污染血液的依据。(3)操作简单、可靠性高。

试验注意事项：凝胶法试验前工作人员手要清洁消毒，试验操作应在洁净工作台进行。在使用洗耳球、移液管取样时，要注意不要将空气吸入溶液中，防止气体中的内毒素进入供试品。由于凝胶反应是不可逆的，所以在反应过程中及观察结果时注意不要使试管受到振荡，以免使凝胶破碎产生假阴性。

温度对鲎试剂有影响：鲎血蛋白酶的最适反应温度35～40℃，国际标准37℃。在一定范围(21～41℃)内当温度升高时，反应速度也升高，25℃时反应速度已经相当快，因此内毒素与鲎试剂混合液不等进入反应仪器，反应已开始，特别注意在夏天室温较高时缩短操作时间，尽快放入仪器中。

pH值对鲎试剂有影响：鲎试剂与内毒素反应的最适pH值为6.5～8.0；pH≤3或≥10时酶活性受抑制。所以排除干扰的方法对供试品进行最大倍数稀释，先在样品中加入一定浓度的标准内毒素，还需要经过碱性调节剂处理后，才能进行试验。

金属离子和弱酸阴离子对鲎试剂有影响：离子对细菌内毒素测定结果影响较大，一方面阳离子如Fe 、AI强度较大会引起内毒素的聚集，造成内毒素局部浓度过高，同时高离子浓度对鲎试剂反应有强抑制作用。所以试验时一定作用检测用水的试用和试用一次无热源的吸头。

动态浊度法加样注意：样品的稀释、内毒素标准品的稀释倍数每步不应大于10倍，否则影响试验的准确性。样品的预处理过程，不同厂家、不同品种的保存液需要加入的调节液的量不同，试验中加入的调节液应根据实际情况而定。

表4 动态浊度法和凝胶法对细菌内毒素检测的比较

动态浊度法加样检测的过程：实验中所应用的动态浊度反应时间法，记录的反应时间和溶液中的内毒素浓度的对应关系。那么，从样品溶液和鲎试剂溶液混合的那一刻开始，反应已经启动。所以，加样后反应立即放入仪器内，尽可能减少因试验加样速度造成的误差。

试验环境要求在洁净的工作台进行，减少误差。

试验误差：鲎试剂灵敏度有差异，不同厂家的鲎试剂虽然标示值(λ)相同，但是差异较大，因为按0.5λ～2λ误差标准都是合格产品；细菌内毒素工作品效价有误差；实验操作有误差，如加样枪、试验环境、操作程序都可能引起试验结果的误差，应引起注意。

总之，细菌内毒素试验凝胶定性法与动态浊度定量法，都是药典规定的方法，凝胶定性法不需要增加设备。动态浊度定量法需要设备，但是灵敏度高，能快速、准确测到样品中的内毒素含量，结果能保存，对原辅材料控制中，有可以追溯性的数据。所以有条件的血站在检测内毒素试验时还是采用浊度定量法。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].2005年版，二部.北京：化学工业出版社，2005： 262.

[2] 药品生物制品鉴定所.中国药品检验标准操作规程[M].北京：中国医药科技电子出版社,2005:278.

[3] 中国国家药品监督管理局.中国生物制品暂行规程[J].北京:化学工业出版社,2000:37-44.