丹参对糖尿病大鼠肾组织VEGF表达的影响及其保护作用*

黄晓磊 王晓东

(泰山医学院附属泰山医院，山东 泰安 271000 )

糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN) 为糖尿病性微血管病变所致，病理学特征性改变表现为肾脏肥大、肾小球和肾小管基底膜增厚、细胞外基质(extracellular matrix,ECM)积聚致系膜区扩张,最后导致肾小球硬化、间质纤维化[1]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一种内皮细胞特异性的丝裂原，已发现VEGF与DN发生发展密切相关[2-3]。本研究我们应用丹参(Salvia miltiorrhiza)对糖尿病大鼠进行干预，观察该药对大鼠生化指标和肾组织VEGF表达的影响，探讨其治疗糖尿病肾病可能的机制。

1 材料和方法

1.1 材料

普通级雄性Wistar大鼠40只，体质量180～220 g[山东大学实验动物中心提供。合格证号:SCXK(鲁) 20050015)]；丹参注射液(三九医药股份有限公司产品)；链脲佐菌素(streptozotocin，STZ，Sigma公司)，批号S-0130规格100 mg；VEGF一抗及免疫组化试剂盒(PV-6001)(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1建立糖尿病大鼠模型 所有大鼠适应性喂养1周后，禁食12 h，随机取28只大鼠，将STZ溶于0.1 mmol/L、pH 4.2的无菌枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液中，配制成10 g/L的STZ，按50 mg/kg一次性腹腔注射，72 h后经尾静脉取血测血糖，连续3次血糖≥16.7 mmol/L者达到模型标准。对照组仅注射等量的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液。

1.2.2动物分组及给药剂量 将成模的24只大鼠随机分成糖尿病模型组和丹参治疗组，每组12只。将预留的12只大鼠设为正常对照组。丹参治疗组自成模之日起按15 g·(kg·d)-1予以灌胃，糖尿病模型组和正常对照组给予等体积的蒸馏水灌胃，1次/d，连续8周。 所有大鼠在整个实验期间喂标准饮食，自由饮水，不用胰岛素。

1.2.3标本收集 ①大鼠精神状态、饮食、毛色、体重(每周记录1次)。②每周尾静脉采血测外周血血糖1次。③大鼠处死前1 d放入代谢笼，准确收集24 h尿液，离心分装后保存于-70℃冰箱中待测尿蛋白、尿肌酐。④于实验8周末在戊巴比妥腹腔注射麻醉下经股动脉收集血标本，保存于-40℃冰箱中待测血糖、血肌酐、尿素氮、胆固醇。经心脏注入4℃预冷的生理盐水反复灌洗，至整个肾脏颜色变苍白后游离，置于冰上，取8 mm3大小肾组织置于40 g/L多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋，制成厚度为4 μm切片，行HE染色。同时行多聚赖氨酸处理切片，进行免疫组化研究。

1.2.4尿白蛋白排泄率与肌酐清除率测定 采用EIA测定尿白蛋白含量，尿白蛋白排泄率(urine albumin excretion rate，UAER)为尿白蛋白含量与24 h尿量乘积；内生肌酐清除率(Ccr)按照下列公式计算：Ccr(ml/min)=Ucr(μmol/L)×V(ml) / Scr(μmol/L)×1440(min)，并用体重(100 g)校正。其中Ucr,Scr,V分别代表尿肌酐、血肌酐浓度、24 h尿量。

1.2.5免疫组织化学采用即用型二步法(非生物素) 石蜡切片常规脱蜡，分级乙醇水化后行微波炉抗原修复15min，按即用型二步法检测试剂盒(PV-6001)说明进行免疫组织化学操作，VEGF多克隆抗体的稀释度为1︰100。显色时间为5 min，蒸馏水冲洗终止反应，中性树胶封片，镜下观察。VEGF抗体染色以胞质出现棕黄色颗粒为阳性信号。每例标本1张切片, 每张切片高倍镜下(×400)随机选择2～3个视野的肾小球及肾小管-间质, 采用Image-proplus 5.0图像分析系统测定该区域平均吸光度值, 取其平均吸光度均值作为结果。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 一般状况

正常对照组大鼠精神状态良好、毛色光泽、进食正常，体重逐渐增加。糖尿病模型组大鼠在实验期间均表现出多饮、多食、多尿、体重下降，生长迟缓，精神萎靡，反应迟钝，毛发竖立无光泽，动作迟缓，蜷卧拱背等症状，丹参治疗组有类似表现，但程度有所缓解。

2.2 一般生化指标

糖尿病模型组大鼠表现为血糖升高、体重降低。丹参治疗组大鼠与糖尿病模型组相比血糖有所下降，体重有所增加，但差异无统计学意义。糖尿病模型组大鼠BUN、CHO、UAER明显高于正常对照组，Ccr明显低于正常对照组。丹参治疗8周大鼠BUN、CHO、UAER低于糖尿病模型组，Ccr高于模型组(表1)。

表1 各组大鼠临床及代谢参数的比较

注：与正常对照组比较，aP<0.01；与糖尿病模型组比较，bP< 0.05,cP<0.01。

2.3 各组大鼠肾组织病理形态学变化

光镜下观察，正常对照组肾小球毛细血管襻开放良好，未见肾小球节段硬化，肾小管上皮细胞排列整齐。糖尿病模型组肾小球体积增大，系膜区弥漫性增宽，细胞外基质增多，系膜细胞增生，基底膜增厚，肾间质有炎细胞浸润。丹参治疗组肾小球轻度肿胀，系膜区轻度增宽，系膜细胞增生，基底膜增厚较糖尿病模型组明显减轻。

2.4 各组大鼠肾组织VEGF表达变化

VEGF在正常对照组主要在肾小球脏层上皮细胞有微弱表达；在糖尿病模型组，肾小球VEGF表达明显增加(P<0.01)，主要表达于肾小球系膜细胞、系膜区及上皮细胞，近曲小管也有微弱表达；在丹参治疗组，上述增加的表达受到显著抑制(P<0.05)。表达强度均采用平均光密度值(OD%值)作为结果记录(表2)。

表2 各组大鼠肾组织VEGF的表达

注：与正常对照组比较,aP<0.01; 与糖尿病模型组比较,bP< 0.05。

3 讨 论

本实验采用STZ诱导大鼠糖尿病模型，8周后大鼠出现体质量下降，相对肾质量、尿素氮、胆固醇、尿蛋白排泄率增加，提示本模型已出现DN早期表现。丹参给药8周对糖尿病大鼠血糖、体质量无明显影响，但改善了肾脏病理损害，减少了尿蛋白排泄率,增加了内生肌酐清除率。研究表明丹参对实验性早期DN有明显保护作用，我们进一步探讨丹参对DN保护作用的可能机制。丹参属活血化瘀类中药，具有降低血黏度、抗凝、抗血栓、促进纤溶、改善微循环等作用。

DN为糖尿病性微血管病变所致，已成为终末期肾衰竭最常见的病因，其主要病理特点是肾脏高灌注、肾小球基底膜增厚和以肾小球系膜区为主的ECM积聚，导致结节性或弥漫性肾小球硬化及小管间质纤维化，出现蛋白尿、肾功能衰竭等功能紊乱。它的发生发展与血管内皮功能障碍密切相关，其蛋白尿出现提示糖尿病肾病存在广泛微血管损害[4-5]。VEGF在DN的发生发展中，已引起广泛重视。VEGF可诱导肾小球基底膜细胞增生、分裂 。VEGF是内皮细胞特异性的丝裂原，能促进内皮细胞增生、迁移，与血管内皮细胞上的受体结合，促进新血管生成，增加血管通透性[6]。 Satchell等[7]发现VEGF可降低肾小球内皮细胞的电阻达12.5 Ω/cm2，从而增加内皮细胞的通透性。VEGF与组胺和缓激肽的作用相似，可直接引起血浆外渗，可致occludin蛋白丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化，引起occludin降解或构象改变，增加血管通透性。另外，VEGF可引起内皮细胞形态改变，如质膜囊泡和囊泡状小体(VVOS)的形成和聚集，通过影响细胞信号转导及胞间转运来调节蛋白尿的形成。VEGF与肾小球系膜细胞上的受体结合活化细胞内MAP激酶信号传递系统，促进系膜细胞合成ECM,还可促进单核细胞及多种细胞因子从血浆中渗出，沉积于肾小球系膜区，促进细胞增殖、ECM沉积，导致肾小球肥大。最近研究[8]表明糖尿病早期肾小球高滤过、肾小球和肾脏增大除上述原因外，常与肾小球滤过面积增加、新生血管生成有关，给予VEGF单克隆抗体或血管生成抑制剂(tumstatin)可缓解实验性糖尿病鼠肾高滤过、肾小球肥大、肾重和尿蛋白排泄，提示VEGF与糖尿病肾脏和DN阶段的微血管结构改变、血管新生有关。此外，VEGF还可诱导IGF-1、TGF-β、MCP-1、ET-1、PDGF等细胞因子的表达，参与DN的形成。

本实验结果显示，丹参治疗组大鼠VEGF在肾脏中的表达明显低于模型组，其平均光密度较模型组均有统计学意义(P<0.05)。证实丹参能降低VEGF在糖尿病大鼠肾脏中的表达，这可能是丹参治疗DN的机理之一。

[1] 叶任高,李幼姬. 临床肾脏病学[M] .北京：人民卫生出版社，2007:241-242.

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[6] Amemiya T，Sasamura H，Mifune M，et al．Vascular endothelial growth factor activates MAP kinase and enhances collagen synthesis in human mesanginal ceils[J]．Kidney Int，1999，56(9):2054-2056．

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