氯霉素固体脂质纳米粒的制备及质量评价

聂绩，黄华

（重庆医科大学药学院高校药物工程研究中心，重庆市 400016）

氯霉素固体脂质纳米粒的制备及质量评价

聂绩＊，黄华#

（重庆医科大学药学院高校药物工程研究中心，重庆市 400016）

目的：制备氯霉素固体脂质纳米粒（CAP-SLN）并考察其质量。方法：选取CAP与甘油棕榈酸硬脂酸酯（Precirol ATO 5）比例（药脂比）、泊洛沙姆含量、乳化温度和初乳-分散相的体积比为考察因素，包封率和载药量为评价指标，设计正交试验并优化处方，利用乳化蒸发-低温固化法制备CAP-SLN；同时以粒径、Zeta电位、包封率、载药量、稳定性及体外释放度为指标评价其质量。结果：最佳制备处方药脂比为1∶10，泊洛沙姆含量为2%，乳化温度为70℃，初乳-分散相的体积比为1∶7。所制纳米粒平均粒径为227nm，Zeta电位为－30.5mV，平均包封率为65.9%，平均载药量为6.59%；于4℃环境中考察30d，其包封率、粒径无显著变化，25℃环境中包封率显著降低、粒径明显增大；在前4h内有明显突释现象，药物累积释放率达58.86%，48h时累积释放率达85.09%，体外释药行为符合Weibull方程。结论：该制剂处方设计和工艺方法可行，制剂质量符合要求，可达到缓释效果。

氯霉素；固体脂质纳米粒；甘油棕榈酸硬脂酸酯；体外释放度

固体脂质纳米粒（Solid lipid nanoparticles，SLN）是一种新型纳米粒给药系统[1]，具缓/控释特性，可提高药物生物利用度及其稳定性等[2，3]，适用于亲脂性药物的包裹[4]。氯霉素（Chloramphenicol，CAP）是治疗沙眼和结膜炎等眼部疾病最常用的抗生素之一，使用中为保证药效需每日给药3～5次，在全身用药时不良反应主要表现为骨髓抑制与再生障碍性贫血，其在生产和贮存中可产生二醇物，使抗菌活性降低。为此，本文选用甘油棕榈酸硬脂酸酯（Precirol ATO 5）为载体材料，以CAP为模型药制备CAP-SLN，并对其制备工艺、理化性质和体外释放度进行考察，以期达到缓释、减少给药次数、降低毒副反应、提高生物利用度的目的，为进一步研制CAP-SLN眼用混悬液提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Zetasizer Nano ZS90激光粒度仪（英国马尔文仪器有限公司）；Hitachi S-3400扫描电镜（日本日立公司）；UV-3105型紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）；82-2恒温磁力搅拌器（上海青浦沪西仪器厂）；数显恒温水浴锅（涿州市国华电器有限责任公司）；RCZ-6B1型药物溶出仪（上海黄海药检仪器厂）。

1.2 试药

CAP原料药（郑州二七长兴化工物资有限公司，批号：090625，含量：98.2%）；CAP标准品（中国药品生物制品检定所，批号：130555-200602，含量：99.4%）；Precirol ATO 5（法国Gattefosse公司）；蛋黄卵磷脂（北京双旋微生物培养基制品厂）；泊洛沙姆（F68，德国Basf公司）；Sephadex-G50（瑞典Pharmacia公司）；无水乙醇（重庆川东化工（集团）有限公司化学试剂厂）；双蒸水、CAP-SLN（规格：0.05%）均由重庆医科大学药学院实验室制备。

2 方法与结果

2.1 CAP-SLN的制备

采用乳化蒸发-低温固化的方法制备。具体操作：精密称取处方量CAP原料药、Precirol ATO 5和蛋黄卵磷脂，置于25mL具塞锥形瓶中，加入10mL无水乙醇，超声约1min，使蛋黄卵磷脂充分溶解，置于70℃恒温水浴锅中保持恒温，构成有机相。精密称取处方量的泊洛沙姆，溶于适量的水中，使恒温保持在70℃，构成水相。用预热至约70℃的注射器缓慢地将有机相注入1300r·min－1搅拌速度下的恒温水相中，继续以此速度搅拌2～3h，形成半透明的初乳，迅速倒入0～2℃的一定量的分散相（与上述水相成分一致）中，继续搅拌2h，即得到半透明、显蓝色乳光的CAP-SLN溶液。

空白SLN的制备方法同上述CAP-SLN的制备方法，只是未加入CAP原料药。

2.2 含量测定

用无水乙醇制备浓度为15µg·mL－1的CAP原料药溶液，在200～400nm范围内进行紫外扫描，其最大吸收波长为273nm。精密称取一定量的空白SLN溶液，用无水乙醇破乳，并稀释至50mL，进行测定，发现在273nm波长处无紫外吸收，表明空白辅料对测定无干扰，方法专属性好。故采用紫外分光光度法测定含量，光谱图见图1。

图1 紫外吸收光谱图A.CAP原料药；B.空白SLNFig1 UV absorption spectrumA.CAP material；B.blank SLN

2.2.1 标准曲线的制备：精密称取CAP标准品5.0mg，置于50mL容量瓶中，用无水乙醇制备成浓度为0.1mg·mL－1的CAP标准品溶液，精密量取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0mL标准品溶液，置于25mL容量瓶中，用无水乙醇稀释成浓度为2、4、8、12、16和20µg·mL－1系列溶液，以无水乙醇为空白，于273nm波长处测定吸收度（A）。以A对标准品溶液浓度（c）进行线性回归，得回归方程：A＝0.0303c+0.0135（r＝0.9999）。结果，CAP检测浓度的线性范围为2～20µg·mL－1。

2.2.2 回收率与精密度试验：用无水乙醇制备4、12、20µg·mL－13种浓度的CAP原料药溶液，各3份，加入相应处方量的空白SLN，测定A，计算回收率。结果平均回收率分别为100.4%、99.9%、99.8%，RSD分别为0.52%、0.27%、0.16%。选取同样的4、12、20µg·mL－13种浓度的CAP原料药溶液，各3份，测定A，计算日内RSD（同日内测5次）和日间RSD（连续5d测定）。日内RSD分别为1.00%、0.48%、0.30%，日间RSD分别为0.71%、0.26%、0.11%。回收率试验结果见表1。

2.3 包封率测定

表1 回收率试验结果（n＝3）Tab1 Results of recovery tests（n＝3）

采用葡聚糖凝胶柱分离-紫外分光光度法测定CAP-SLN的包封率。

精密量取1.0mL的CAP-SLN溶液，缓慢置于已装好的Sephadex-G50凝胶柱（1.5cm×30cm）上，经预试验考察后，选择流动相为水，流速为1.0mL·min－1，用试管收集流出液，每2mL收集1管，绘制分离曲线，详见图2。

图2 CAP-SLN和游离CAP分离曲线Fig2 Elution curves of CAP-SLN and free CAP

收集、合并有蓝色乳光溶液，置于25mL棕色容量瓶中，用无水乙醇破乳并稀释，以紫外分光光度法在273nm波长处测定A1。另精密量取1.0mL的CAP-SLN溶液，置于25mL棕色容量瓶中，用无水乙醇破乳并稀释，在273nm波长处测定吸光度A2。

2.4 正交试验

根据单因素试验结果，确定了主要影响因素：即药脂比（CAP与Precirol ATO 5的比例）（A）、泊洛沙姆含量（B，%）、乳化温度（C，℃）和初乳-分散相的体积比（D），以正交试验表L9（34）进行试验，以包封率和载药量为评价指标进行考察。正交试验因素水平见表2，正交设计试验结果见表3（由表2、表3可见，极差R反映各因素对指标影响的程度，R越大，影响程度越大）。

表2 因素水平表Tab2 Factors and levels

由表3结果分析，以包封率为衡量指标，影响程度排列为A＞B＞D＞C，其中A3＞A2＞A1，B2＞B3＞B1，C2＞C3＞C1，D3＞D1＞D2，得出最佳优化处方A3B2C2D3。以载药量为衡量指标，影响程度排列为A＞B＞D＞C，其中A1＞A2＞A3，B2＞B3＞B1，C2＞C3＞C1，D3＞D2＞D1，得出最佳优化处方 A1B2C2D3。从试验结果得出，当药脂比较大时（1∶15），药物包封率较高；药脂比较小时（1∶5），其载药量较高。经过综合考虑，确定A2为最佳药脂比，则最佳优化处方为A2B2C2D3，即药脂比为1∶10，泊洛沙姆含量为2%，乳化温度为70℃，初乳-分散相的体积比为1∶7。按最优处方制备3批样品，测得包封率分别为65.6%、66.3%和65.7%，平均包封率为65.9%，RSD＝0.57%；载药量分别为6.56%、6.63%、6.57%，平均载药量为6.59%，RSD＝0.57%。

表3 正交设计试验结果Tab3 Results of orthogonal design

2.5 形态观察

按最优处方制备的CAP-SLN溶液，于扫描电镜下观察，其形态为大小较均匀的类球形，详见图3。

图3 CAP-SLN扫描电镜照片（×30000）Fig3 Transmission electron microphotograph of CAP-SLN（×30000）

2.6 粒径和Zeta电位

用适量水稀释按最优处方制备的CAP-SLN溶液，用Zetasizer Nano ZS90激光粒度仪测定粒径和Zeta电位，测得平均粒径为227nm，Zeta电位为－30.5mV。粒径分布与Zeta电位结果详见图4、图5。

2.7 稳定性考察

重新制备3批样品（批号：100325-1、100325-2、100325-3），分别放入4℃和25℃的环境中，于0、5、15、30d观察其平均包封率和平均粒径的变化，考察其稳定性，结果见表4。

表4 稳定性试验结果Tab4 Results of stability tests

由表4可见，CAP-SLN在4℃储存温度下包封率和粒径无显著变化，稳定性良好；在25℃储存温度下包封率显著降低，粒径明显增大，稳定性较差。

2.8 体外释放度考察

精密量取4.0mL的CAP-SLN溶液，放入预处理好的透析袋中，两端用细线系紧，放入装有200mL释放介质的溶出杯中。根据眼内pH为7.4、眼表温度为34℃的常规，本试验采用以下条件：释放介质为pH 7.4磷酸盐缓冲液，水浴温度为34℃，转速为100r·min－1。将释放介质分别于0.5、1、2、4、8、12、24、48h取样5mL，每次取液后补加同体积的释放介质，用紫外分光光度法进行测定。采用相同方法考察CAP原料药的体外释放度，CAP原料药和CAP-SLN的累积释放曲线结果见图6。

图6 CAP原料药和CAP-SLN累积释放曲线Fig6 Drug release curve of CAPand CAP-SLN

由图6可见，CAP原料药在4h内的累积释放率已达到95.6%；CAP-SLN在前4h内有明显的突释现象，药物累积释放率达到58.86%，而后缓慢释放药物，48h时累积释放率达85.09%。将CAP-SLN累积释放量（Q）和时间（t）进行拟合，结果符合Weibull方程：

3 讨论

3.1 CAP-SLN制备方法

本试验采用乳化蒸发-低温固化的方法制备样品，把药物、聚合材料和表面活性剂溶于半极性的且与水互溶的溶剂中，然后在磁力搅拌的基础上将溶液注入非溶剂（一般为含表面活性剂的水）中。由于溶剂的快速扩散，纳米粒随即形成。因CAP略溶于水，药物大部分存在于Precirol ATO 5所形成的乳滴中，在泊洛沙姆和蛋黄卵磷脂的乳化作用下形成CAP的纳米乳液。把乳液分散于0～2℃冰水中，乳液的温度急剧降到Precirol ATO 5熔点以下，乳液凝固成固态Precirol ATO 5纳米粒。如此可提高CAP的稳定性，避免产生化学降解。但也有人认为SLN是热力学不稳定系统，在较短的时间内就会产生粒径的增大、粒子聚合或胶凝[5]。Zeta电位也与纳米粒体系的稳定性密切相关，在－60～－30mV范围内体系物理性质稳定，因此测定Zeta电位可以预测纳米粒体系的储藏稳定性[6]。本试验制备的CAP-SLN的Zeta电位值为－30.5mV，属热力学稳定系统。该制剂处方设计和工艺方法可行，制剂质量符合要求，可达到缓释效果。

3.2 辅料和溶剂的选择

本试验采用的脂质是Precirol ATO 5。在考察脂质材料对CAP-SLN性质的影响时，选择了4种脂质材料：硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、Compritol 888ATO和Precirol ATO 5。结果发现，硬脂酸作载体的CAP-SLN稳定性非常差，储存于4℃条件下，在4h内就开始浑浊，有絮状物产生；单硬脂酸甘油酯作载体的CAP-SLN稳定性好，但包封率低；Compritol 888ATO作载体的CAP-SLN包封率高，但稳定性低；相比而言，PrecirolATO 5作载体的稳定性和包封率均较好。Precirol ATO 5[7]其主要成分是硬脂酸和棕榈酸，毒性低于高分子合成材料，在体内可以降解且生理相容性好，同时理化性质稳定，可改变单一脂质晶格的高度有序性，使药物更易镶嵌于脂质晶格中，或是存在于脂质的脂肪酸链间、脂质层间，有利于药物的稳定。另外该材料熔点为60℃，相对较低，有利于CAP-SLN的制备和理化性质的稳定。

蛋黄卵磷脂是细胞膜组成成分，毒性低，可以在体内降解且生理相容性良好，当卵磷脂和泊洛沙姆合用时，泊洛沙姆可插入卵磷脂单分子层形成紧密充填的混合层，从而减小粒径，提高稳定性，故选其作为表面活性剂[8，9]。溶剂选择的是无水乙醇，满足半极性且与水互溶的性质。蛋黄卵磷脂也易溶于无水乙醇，有利于油相混合均匀。

3.3 体外释放度的测定

本试验采用透析法考察CAP-SLN的体外释放规律。眼用制剂的体外释放度考察应遵循眼表温度，所以选择34℃。从体外释放曲线可见，样品在初期有突释的现象，可能是由于存在未包入脂质材料的游离CAP，而产生的突释现象。药物的快速释放，可使CAP在眼部快速达到抑菌浓度，产生药效。由于大部分的药物包裹进入脂质材料的骨架结构中，从而缓慢地释放药物，所以8h后释放趋于平稳，达到了较好的缓释目的。后续试验将对CAP-SLN眼用制剂在兔眼内的药动学进行研究，考察其对兔眼的刺激性、在兔眼内的滞留时间和在兔眼泪液及房水内的药动学，对其在体内实现缓释、降低毒副反应、提高生物利用度的作用进行验证。

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Preparation and Quality Evaluation of Chloramphenicol Solid Lipid Nanoparticles

NIE Ji，HUANG Hua
（Chongqing Engineering Research Center for Medicine，College of Pharmacy，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

OBJECTIVE：To prepare Chloramphenicol solid lipid nanoparticles（CAP-SLN）and to study the quality of it.METHODS：The preparation technilogy of CAP-SLN was optimized by orthogonal test with the entrapment efficiency and drug loading amount as index and with proportion of CAP to Precirol ATO 5（drug-to-lipid ratio），amount of poloxamer，emulsifying temperature，volume ratio of emulsion-disperse phase as factors.CAP-SLN was prepared by emulsification evaporation-low temperature solidification technique.The quality of preparation was evaluated with particle size，Zeta potential，drug-loading amount，stability and in vitro drug release rate as index.RESULTS：The optimal formulation was as follows：drug-to-lipid ratio of 1∶10，the weight of poloxamer of 2%，emulsifying temperature of 70℃，drug-to-lipid of 1∶7.The mean diameter of CAP-SLN was 227nm.The zeta potential was－30.5mV.The entrapment efficacy was 65.9%.The average drug-loading amount was 6.59%.CAP-SLN could keep stable at 4℃at least for one month.The entrapment efficacy of CAP-SLN at 25℃decreased significantly while particle size increased.The burst release of CAP-SLN was found during the former 4h.The drug release rate of it was 58.86%at 4h and reached 85.09%at 48h.The in vitro drug release behavior was in line with Weibull equation.CONCLUSION：The preparation technique and formulation are practicable.CAP-SLN is up to quality standard and can achieve sustained-release effects.

Chloramphenicol；Solid lipid nanoparticles；Precirol ATO 5；In vitro drug release rate

R927.11；R944.1+6

A

1001-0408（2011）17-1598-04

＊硕士研究生。研究方向：速释及缓、控释制剂。电话：023-68485078

#通讯作者：教授，硕士研究生导师。研究方向：速释及缓、控释制剂。电话：023-68485078

2010-08-03

2010-09-20）

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