胸腺五肽脂质体的研制

裴斐，宋宏新，张凤龙，赵金礼

（1.陕西科技大学生命科学与工程学院，西安市 710021；2.陕西九州生物科技股份有限公司，西安市 710075）

胸腺五肽脂质体的研制

裴斐1＊，宋宏新1#，张凤龙2，赵金礼2

（1.陕西科技大学生命科学与工程学院，西安市 710021；2.陕西九州生物科技股份有限公司，西安市 710075）

目的：制备胸腺五肽脂质体并进行质量评价。方法：采用复乳法制备胸腺五肽脂质体，以聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）及卵磷脂为成球材料、以胸腺五肽为主药制备脂质体。以明胶浓度、PLGA浓度和卵磷脂浓度为考察因素，以包封率和载药量为考察指标设计L9（34）正交试验优化基质处方并进行验证试验。通过测定优化处方所制脂质体粒径、包封率、体外累积释放百分率等评价脂质体质量。结果：优化基质处方为明胶、PLGA和卵磷脂浓度分别为100、200、100mg·mL－1。所制脂质体形态完整，平均粒径为（9.03±0.83）μm，载药量与包封率分别为（1.81±0.03）%与（74.4±1.4）%，20d的累积释药百分率达90%以上。结论：所制胸腺五肽脂质体工艺简单、重现性好，包封率和载药量高，具有显著的缓释作用。

胸腺五肽；聚乳酸-羟基乙酸共聚物；脂质体；制备；优化基质处方；正交试验；质量评价

胸腺五肽（Thymopentin，TP-5）系胸腺生成素Ⅱ第32～36位的多肽片断（即精-赖-天冬-缬-酪氨酸），为胸腺生成素Ⅱ的免疫活性中心，能增进机体免疫力[1]。主要用于治疗特应性皮炎、慢性淋巴细胞性白血病、慢性乙型肝炎、各种原发性或继发性T细胞缺陷疾病、某些自身免疫性疾病、各种细胞免疫功能低下的疾病以及肿瘤的辅助治疗。临床上常用的剂型为注射用冻干灭菌粉末。但是，TP-5在人血浆中很快由蛋白酶和氨肽酶降解为氨基酸，半衰期约为30s[2]，需频繁注射给药，患者依从性差。因此，开发其长效注射剂是国内外长期研究的方向。

为此，笔者以聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）及大豆卵磷脂为载体，采用复乳法制备TP-5脂质体。该法是在TP-5微球的基础上进行改良的，即在PLGA外层再次用卵磷脂进行包裹，去掉了微球制备工艺中离心、水洗和冻干等操作，直接用橄榄油将脂质体混悬分散后低温保存，大大简化了制备工艺。所制备脂质体设计的药物含量约20mg·mL－1，包封率和载药量也较理想，为开发TP-5脂质体新剂型奠定了初步基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

KS-150超声波细胞粉碎机（宁波科生仪器厂）；AC135精密电子天平（瑞士梅特勒公司）；85-1磁力搅拌器（上海浦东物理光学仪器厂）；XS-212光学显微镜（南京江南光电股份有限公司）；高效液相色谱（HPLC）系统，包括1525梯度泵、2996PDA紫外检测器、EMPOWER色谱工作站（美国Waters公司）。

1.2 试药

TP-5（陕安九州生物科技股份有限公司合成，批号：20091126，纯度：＞99%）；PLGA（山东省医疗器械研究所，Mr＝15000，LA∶GA＝50∶50）；聚乙烯醇、明胶（天津市科密欧化学试剂有限公司）；大豆卵磷脂（上海东尚实业有限公司，注射级）；胆固醇（上海化学试剂站分装厂，批号：950517）；其他试剂均为市售色谱纯或分析纯。

2 方法与结果

2.1 TP-5脂质体的制备

采用改进的复乳法制备TP-5脂质体[3]。将40mg TP-5溶解于100μL明胶水溶液作为内水相，PLGA加入3mL二氯甲烷反复振荡充分溶解后作为油相，将内水相加入油相在90W的功率下超声乳化10s得W/O1初乳，在磁力搅拌机搅拌条件下将初乳倒入10mL含大豆卵磷脂和胆固醇的二氯甲烷溶液中（卵磷脂与胆固醇质量比为2∶1），经过高速搅拌2min得到W/O1/O2复乳，室温条件下（25℃）继续缓慢搅拌10h，充分挥发二氯甲烷并固化脂质体后，加入10mL橄榄油继续搅拌10h将其分散置于4℃环境保存。

影响复乳法制备脂质体因素繁多，在预试验基础上确定对TP-5脂质体的制备和性质影响较显著的3个因素，即明胶浓度（A）、PLGA浓度（B）、卵磷脂浓度（C），单因素确定每一因素的3个水平（浓度），按L9（34）正交表设计试验。考察每组试验的包封率（Encapsulation efficiency）和载药量（Drug loading），并按正交试验结果得出的最优制备工艺条件，重复试验3次，考察脂质体制备工艺的重现性。因素水平见表1。

表1 因素水平表Tab1 Factors and levels

2.2 脂质体载药量、包封率的测定

2.2.1 TP-5色谱条件及线性范围。以0.01mol·L－1的磷酸盐缓冲液（pH＝7.4）为溶剂，制备质量浓度为50、100、200、300、400、500mg·L－1的TP-5标准溶液，采用HPLC法测定。色谱条件：色谱柱：Kromasil C18（250mm×4.60mm，5μm），柱温：25℃，检测波长：215nm，流动相：15%乙腈（含0.1%三氟乙酸），流速：1.0mL·min－1，进样量：20μL。计算得TP-5质量浓度（c）和峰面积（A）的线性回归方程：A＝1437.2c－6159.6（R2＝0.9998，n＝6），检测浓度线性范围为50～500mg·L－1。

2.2.2 精密度试验[4]。以0.01mol·L－1的磷酸盐缓冲液（pH＝7.4）为溶剂精密制备低、中、高（50、200、500mg·L－1）3种浓度的TP-5标准溶液，在“2.2.1”色谱条件下测定，同日重复测定5次，隔日测定1次，共测5d。结果低、中、高3种浓度的日内RSD分别为1.37%、0.98%和1.95%（n＝5），日间RSD分别为1.45%、1.89%和1.27%（n＝5）。

2.2.3 回收率试验。以0.01mol·L－1的磷酸盐缓冲液（pH＝7.4）为溶剂精密制备低、中、高（50、200、500mg·L－1）3种浓度的TP-5标准溶液，取按照优化条件制备的空白脂质体9份，各100mg，精密加入各浓度的TP-5标准溶液100μL，低、中、高3种浓度各3份，加蒸馏水定容到1mL，充分振荡后10000r·min－1离心10min。取上层清液作为样品溶液，膜过滤后按“2.2.1”色谱条件下测定。结果低、中、高3种浓度的回收率分别为99.47%、100.26%和99.86%，RSD分别为0.65%、0.89%和1.21%。

2.2.4 TP-5载药量、包封率的测定。准确称取TP-5脂质体100mg加蒸馏水定容到1mL，充分振荡后10000r·min－1离心10min。取上层清液作为样品溶液，膜过滤后按照“2.2.1”条件采用HPLC法测定TP-5含量。将测量结果代入载药量、包封率的公式进行计算：

2.3 处方优化试验方案及结果

对于脂质体来说，包封率（X）和载药量（X′）都是极其重要的指标，前者可衡量制剂在临床应用中的可行性，后者代表制剂工艺的可行性。两者同等重要，因此权重系数均设为0.5，其综合评分可由以下公式计算：Y＝50×（Xi/Xmax）+50×（Xi′/X′max）。

制备TP-5脂质体的正交试验结果见表2，方差分析结果详见表3。

表2 正交试验结果Tab2 Results of orthogonal experiments

表3 方差分析结果Tab3 Analysis of variance

由试验结果的直观分析和方差分析结果可知：PLGA浓度（因素B）对脂质体的包封率影响最大，其次为卵磷脂浓度（因素C），明胶浓度（因素A）影响最小，最佳脂质体制备工艺为A2B2C2（即明胶浓度100mg·mL－1、PLGA浓度200mg·mL－1和卵磷脂浓度100mg·mL－1。

2.4 质量评价

2.4.1 TP-5脂质体的平均粒径、载药量与包封率。按照优化后的处方和工艺条件制备3批TP-5脂质体，测定其平均粒径、载药量和包封率。平均粒径测定方法：取制备好的TP-5脂质体用水混悬后，置于载玻片上，用显微镜观察粒子的形态，并用显微镜测微尺测定粒径大小，结果见表4。

表4 3批TP-5脂质体的平均粒径、载药量与包封率测定结果Tab4 Mean particle size，drug loading capacity and encapsulation coefficiency of 3batches of thymopentin liposome

2.4.2 形态观察。取其中1批置于光学显微镜下观察形态，结果脂质体表面光滑圆整，球体均匀度较好，详见图1。

图1 TP-5脂质体光学显微镜下形态（×400）Fig1 Photomicrograph of thymopentin liposome（×400）

2.4.3 TP-5脂质体体外释药性能。对3批按照优化条件制备的TP-5脂质体进行体外释药考察。考虑到试验所用溶出量较少，故在选择溶出检测方法时，排除了大容量的篮法和桨法，而选用小杯法。每批精密称取含药脂质体100mg各7份分别置于小杯内，以0.01mol·L－1磷酸盐缓冲液50mL（pH＝7.4、含0.02%叠氮钠作为抑菌剂）为溶出介质，在100r·min－1转速、（37±0.5）℃条件下进行脂质体的体外释放度测定。分别在1、2、3、7、10、15、20d时取出1个小杯。从中取5mL溶液，2000r·min－1离心 10min，吸取上层清液，膜过滤后按照“2.2.1”条件测定TP-5含量。根据已知脂质体载药量及TP-5的释放量计算各时间点的累积释药百分率，绘制脂质体的体外累积释药曲线，详见图2。

由图2可看出，TP-5脂质体具有明显的缓释作用，首日突释小于20%，其后药物释放速度比较稳定，20d的累积释药百分率在90%以上。

3 讨论

本文使用的脂质体制备方法为自行研究首创，是在微球制备方法的工艺上进行改进的。传统的微球制备方法只采用PLGA一种材料包裹药物[5]，认为所制备微球未包裹的药物分为2部分，一部分游离在溶剂体系中，另一部分则依附于PLGA表面。而本文中脂质体制备工艺在PLGA包裹TP-5完成后再用卵磷脂进行二次包裹，这样可以将微球表面的TP-5也包裹进去，因此比微球制备工艺包封率得到了提高；同时最外层用橄榄油而不是水来分散脂质体，避免了TP-5向外水相的扩散，因此制得的TP-5脂质体具有较高的包封率和载药量。

图2 3批TP-5脂质体的体外释药曲线Fig2 Release curves of 3batches of thymopentin liposome in vitro

综上所述，所制胸腺五肽工艺简单、重现性好，包封率和载药量高，具有显著的缓释作用。

本文所制备TP-5脂质体可采用皮下包埋的给药途径，市售TP-5注射液用法用量为每次1mg，每日1～2次。笔者下一步将进行动物实验以考察所制TP-5脂质体给药量及其体内释药规律和释药动力学，并进一步对脂质体在体内与体外释药的相关性进行考察和比较，以及进行药效学研究，以便对TP-5新药剂型的研发提供参考。

（注：本实验是在陕西九州生物科技股份有限公司多肽实验室完成）

[1] Gonser S，Weber E，Folkers G.Peptides and polypeptides as modulators of the immune response：thymopentin——an example with unknown mode of action[J].Pharm Acta Helv，1999，73（6）：265.

[2] Tischio JP，Patrick JE，Weintraub HS，et al.Short in vitro halflife of thymopoietin 32-36pentapep tide in human plasma[J].Int J Peptide Protein Res，1979，14（5）：479.

[3] [英]V.P.托尔钦林，V.魏西希主编.邓意辉，徐 晖译.脂质体[M].北京：化学工业出版社，2007：3-8.

[4] 胡展红，石 琦，张学农.去甲斑蝥素脂质体的制备工艺优化及其药剂学性质研究[J].中国药房，2009，20（4）：279.

[5][英]J.西尼尔，M.拉多米斯基主编.郑俊民译.可注射缓释制剂[M].北京：化学工业出版社，2005：98-103.

Study and Preparation of Thymopentin Liposomes

PEI Fei，SONG Hong-xin
（College of Life Science and Engineering，Shaanxi University of Science and Technology，Xi’an 710021，China）
ZHANG Feng-long，ZHAO Jin-li
（Shaanxi Jiuzhou Biotechnology Co.，Ltd.，Xi’an 710075，China）

OBJECTIVE：To prepare thymopentin liposomes and to evaluate the quality of it.METHODS：Thymopentin liposomes were prepared by double emulsion process using poly（lactic-co-glycolic acid）（PLGA）and lecithin as carrier and thymopentin as main components.The preparation method was optimized by orthogonal experiment L9（34）using the concentration of gelatin，PLGA and lecithin as factors and with encapsulation coefficency and drug loading capacity as index.The particle size，encapsulation coefficency and in vitro accumulative release rate of liposomes were determined to evaluate the quality of it.RESULTS：The concentrations of gelatin，PLGA and lecithin in optimal base formula were 100mg·mL－1，200mg·mL－1，100mg·mL－1，respecetively.Prepared liposomes were complete in shape with mean particle size of（9.03±0.83）μm.The drug loading capacity and encapsulation coefficiency were（1.81±0.03）%and（74.4±1.4）%.Accumulative release rate was more than 90%in 20days.CONCLUSION：Preparation technology is simple and reproducible.Prepared thymopentin liposomes have high drug loading capacity and encapsulation coefficiency，and sustained-release effect.

Thymopentin；Poly（lactic-co-glycolic acid）；Liposomes；Preparation；Optimal base formula；Orthogonal experiment；Quality evaluation

R943；R977.4；R979.5

A

1001-0408（2011）17-1595-03

＊硕士研究生。研究方向：药物新剂型。E-mail：p03570311@163.com

#通讯作者：教授，硕士研究生导师。研究方向：生化制药。E-mail：hongxinsong@163.com

2010-07-12

2010-08-31）