磷矿分解菌DPB5液体培养条件研究

周毅峰，唐巧玉，黄志敏

(湖北民族学院 生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000)

磷是植物体内许多有机化合物的组成成份，参与植物体内的各种代谢过程，在植物生长发育中起着重要的作用[1].土壤中的磷素是以无机和有机化合物这两种状态存在，土壤中能被植物直接吸收利用的有效态磷仅占全磷的2%～3%[2].无效态的磷不能被植物直接吸收，必须在微生物的作用下转变成可利用的无机态形式才能被利用[3].

磷矿资源是我国重要的战略资源，我国磷矿资源储量较大，中低品位矿多，富矿少；胶磷矿多，采选难度大[4].将解磷微生物与磷矿同时施到植物根际，利用解磷微生物来分解磷矿及土壤中无效态的磷，并释放出有效的无机磷是一条开发磷矿资源有效廉价的途径[1].本文在前期的研究基础上，对已筛选出的磷矿分解菌DPB5培养条件进行了研究，为发酵培养解磷微生物菌剂提供基础.

1 材料与方法

1.1 菌株来源

磷矿分解菌DPB5由课题组分离保存，初步确定为芽孢杆菌属的枯草芽孢杆菌(B.licheniformis)[1].

表1 正交试验因素水平表

表2 不同C源对磷矿分解菌DPB5生长影响的方差分析(n=3，α= 0.05)Tab.2 The variance analysis of influence for the growth of strain DPB5 by adding variety of carbon(n=3，α=0.05)

表3 不同N源对磷矿分解菌DPB5生长影响的方差分析(n=3，α= 0.05)Tab.3 The variance analysis of influence for the growth of strain DPB5 by adding variety of nitrogen(n=3，α=0.05)

1.2 培养基

牛肉膏-蛋白胨培养基[1]

1.3 单因素试验

最佳C源、N源、培养温度、初始pH、摇床转速的筛选方法参照文献[5-6].

1.4 正交试验

根据单因素实验分析结果，选择如表1所示的水平因素进行正交试验.

1.5 生长曲线的测定

参照文献[7]进行生长曲线的测定.

1.6 数据分析

利用excel和SPSS软件进行差异分析.

2 结果与分析

2.1 最佳C源的筛选

碳源是微生物生长需要量最大的营养物[8].为选择出磷矿分解菌DPB5培养条件，在单因素实验中首先进行最适碳源的筛选，以培养液的OD600值来评价其生长状况，结果见表2和图1.从方差分析结果可以看出，在α=0.05的精度水平上，各处理组间F值大于F临界值，P值为1.605×10-3，说明C源对磷矿分解菌DPB5生长具有显著的影响.

从各处理平均数分析来看，玉米粉作为C源与其他C源相比，对菌株DPB5生长有极显著性影响，发酵后培养液的光密度最高达到2.008.另外，玉米粉的成本较低，因此选择玉米粉作为菌株DPB5的C源最为合适.

2.2 最佳N源的筛选

氮是构成重要生命物质蛋白质和核酸等的主要元素，氮占细菌干重的12%～15%[8]，为选择出磷矿分解菌DPB5培养条件，在单因素实验中进行了最适氮源的筛选，以培养液的OD600值来评价其生长状况，结果见表3和图2.从方差分析可以看出，在α=0.05的精度水平上，各处理组间F值远远大于F临界值，P值为1.76×10-18，证明加不同N源对磷矿分解菌DPB5生长有极显著的影响.

图1 不同碳源对磷矿分解菌DPB5生长的影响 图2 不同氮源对磷矿分解菌DPB5生长影响Fig.1 The effects on growth of strain DPB5 in various carbon nutrition Fig.2 The effects on growth of strain DPB5 in various nitrogen nutrition

从图2中可以看出，有机态氮源的OD600值极显著的大于无机态氮源，各种有机氮源对磷矿分解菌DPB5影响存在极显著的差异.蛋白胨、麦麸、豆饼粉、牛肉膏、酵母膏是有机氮源，尿素、碳酸氢铵、硫酸铵是无机碳源，这说明有机氮源作为菌株DPB5的培养基N源比无机态氮源合适.在有机氮源中牛肉膏作为氮源在生长16 h后，OD600值达到2.736，故在该培养条件下应选用牛肉膏DPB5最适氮源.

表4 温度对磷矿分解菌DPB5生长影响的方差分析(n=3，α=0.05)Tab.4 The variance analysis of influence for the growth of strain DPB5 in different temperature conditions(n=3，α=0.05)

表5 初始pH对磷矿分解菌DPB5生长影响的方差分析(n=3，α=0.05)Tab.5 The variance analysis of influence for the growth of strain DPB5 in variety initial pH conditions(n=3，α=0.05)

表6 转速对磷矿分解菌DPB5生长影响的方差分析(n=3，α=0.05)Tab.6 The variance analysis of influence for the growth of Strain DPB5 in different speeds of shaking table(n=3，α=0.05)

2.3 培养温度对磷矿分解菌DPB5生长的影响

培养温度是影响微生物生长繁殖的最重要的因素之一[8]，为选择出磷矿分解菌DPB5培养条件，在单因素实验中进行了最适培养温度的筛选，以培养液的OD600值来评价其生长状况，结果见表4和图3.从方差分析可以看出，在α=0.05的精度水平上，各处理组间F值大于F临界值，P值为3.42×10-6，证明不同培养温度对磷矿分解菌DPB5的生长有极显著的影响.

从各处理平均数分析可以看出，当培养温度为45℃和50℃时，发酵后培养液的OD600值与其余3组相比均有显著性差异，发酵后培养液的光密度与其他的相比较要大些，分别为2.728、2.4585.它们两组之间虽然没有显著性差异，但温度为45℃时的OD600值比温度为50℃的OD600值大，且温度低耗能较少，所以45℃为磷矿分解菌DPB5的最适生长温度.

2.4 初始pH对磷矿分解菌DPB5生长的影响

培养基初始pH的变化会影响接种后菌体生长的延迟期和生长速率，进而影响最终菌体浓度[8].为选择出磷矿分解菌DPB5培养条件，在单因素实验中进行了培养基最适初始pH的筛选，以培养液的OD600值来评价其生长状况，结果见表5和图4.从表8中方差分析结果来看，在α=0.05的精度水平上，各处理组间F值大于F临界值，P值为2.282 52×10-2，证明初始pH对磷矿分解菌DPB5的生长有显著的影响.

图3 不同培养温度对磷矿分解菌DPB5生长的影响 图4 初始pH值对磷矿分解菌DPB5生长的影响

从各处理平均数分析可以看出，当培养基的pH为5.5与pH在7.5～8.0时，对菌株DPB5生长的影响无显著性差异.从各处理平均数值大小来看，当初始pH高于8.0或低于6.0时，菌体生长数量较低.当初始pH在6.0～7.5时，菌体生长速度较快，因而，初始pH选取6.0～7.0较为合适，其中以pH6.0为最好，其OD600值达到1.923.

2.5 转速对磷矿分解菌DPB5生长的影响

枯草芽孢杆菌的发酵是需氧性发酵过程，通过改变摇床转速来调节通气量，转速太小，通气量小，不利于菌体生长；但摇床转速太大时，可能会引起菌体自溶，使得生物量减少[8].为选择出磷矿分解菌DPB5培养条件，在单因素实验中进行了培养基最适初始pH的筛选，以培养液的OD600值来评价其生长状况，结果见表6和图5.从方差分析可以看出，在α=0.05的精度水平上，各处理组间F值大于F临界值，P值为3.07×10-5，证明转速对磷矿分解菌DPB5的生长有极显著的影响.

从各处理平均数分析，当转速在120～180 rpm范围内，转速每提高30 r/min，对菌株DPB5生长的影响有显著性差异，从平均数变化来看，在一定转速范围内发酵液的OD600值随着转速提高而增大，转速和OD600值呈极显著的线性相关，相关系数r=0.978 110(大于0.75)，线性方程y=0.683 6x(y：OD600值，x：转速r/min).当转速大于180 r/min时，菌株DPB5的生长开始下降，其OD600值变小.装量和转速是影响摇瓶中溶氧浓度的两个重要因素，在装量一定的情况下，在一定范围内转速越高，溶氧浓度越高.转速超过180 r/min后，容易引起菌体自溶.故磷矿分解菌DPB5的最适转速为180 r/min.

图5 摇床转速对磷矿分解菌DPB5生长的影响Fig.5 The effects on growth of strain DPB5 by the speeds of culture shaking table

图6 磷矿分解菌DPB5生长曲线Fig.6 The growth curve of strain DPB5

2.6 正交试验

以培养结束时的光密度(OD600)作为考察指标.根据表7分析，N源和温度是影响磷矿分解菌DPB5生长较为显著的因素，5个因素对磷矿分解菌DPB5培养影响的显著性次序为蛋白胨>温度>转速>玉米粉>pH，五个因素的最佳配比为A3B4C3D4E2，即碳源为土豆粉、氮源为酵母膏、pH为6.5、转速为240 r/min、温度为40℃.正交实验的结果与单因素的结果有一定差异，说明各条件之间存在着相互影响.在相同的接种情况下，利用最佳的培养条件摇床培养16 h后，测得发酵液OD600为2.079，比正交实验各组合的生长情况好.

表7 摇瓶培养正交试验结果Tab.7 Results of orthogonal test by shaking flask culture

2.7 生长曲线的测定

从图6可以看出，该生长曲线跟细菌的正常生长曲线相似，对数期的生长曲线平滑，没有明显的稳定期，细菌衰老的速度较一般细菌慢，且在衰亡期后期还出现一定上升趋势.0～4 h处于潜伏时期，4～12 h处于对数生长期，12 h后开始进入平稳期，并慢慢进入消亡期.

3 讨论

枯草芽孢杆菌对磷矿具有分解作用[1]，主要分解无机态磷，且是农业部规定的可以释放到自然界的安全菌株[9]，可将其作为生物肥料添加的微生物菌剂使用.本文在前期研究基础上，对其液体培养条件进行了优化.其优化条件与孙剑秋等优化的解磷枯草芽孢杆菌在氮源、碳源方面有一定区别[10].本文以为生产更多的微生物菌剂，来优化其培养条件，而孙剑秋等主要研究了在人工培养条件下枯草芽孢杆菌解磷能力.此外，通过测定该株枯草芽孢杆菌生长曲线，来确定该菌株适合在人工培养12 h左右进行基质的接种，配制生物有机肥.

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[2] 林启美，赵小蓉,孙焱鑫,等.四种不同生态环境中解磷细菌的数量及种群分布[J].土壤与环境，2009(1):34-37.

[3] 姜绍芬,姜瑞波.解磷微生物肥料的作用和应用[J].土壤肥料,1994(2):46-48.

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[5] 周毅峰,邓桂芳,秦恩华.桐粕降解菌DBTM6培养条件及降解酶活性的研究[J].湖北民族学院学报:自然科学版,2010,28(1):13-17.

[6] 周毅峰,周宁,秦恩华.桐粕降解菌DBTM1培养条件的优化[J].湖北农业科学,2009,48(7):1 615-1 618.

[7] 张玲.微生物学实验指导[M].北京:北京交通大学出版社,2007:104-106.

[8] 周德庆.微生物学教程[M].2版.北京:高等教育出版社,2002：82,84,160,165,185.

[9] 游银伟,王梅,江丽华,等.高效解磷菌BacillussubtilisP-1的离子束诱变育种[J].西南农业学报,2009,22(4):1 020-1 022.

[10] 孙剑秋,王鹏,张建,等.优良解磷菌株诱变选育与解磷培养基优化[J].核农学报,2010,24(1):41-45