喷施草甘膦对大豆表皮细胞超微结构影响的研究

卜贵军

(1.湖北省生物资源保护与利用重点实验室(湖北民族学院)，湖北 恩施 445000；2.湖北民族学院 生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000)

草甘膦是内吸的，无选择性的除草剂.草甘膦可以通过抑制莽草酸途径，来抑制芳香族氨基酸的合成，从而除掉杂草.但由于它是非选择性的，在除掉杂草的同时，如果遇到绿色作物，也会对其造成伤害.随着生物技术的发展，一批抗草甘膦转基因作物[1-2]的出现，使问题得到解决.而转基因大豆中主要是抗除草剂草甘膦转基因大豆[3-7]，到2007年已占到全球大豆的64%[8].

抗草甘膦大豆通过转入CP4-EPSPS，使得大都对草甘膦不敏感，这样芳香族氨基酸能够继续合成，大豆生长发育能正常进行.

种植抗草甘膦大豆就需要配套的使用大量的草甘膦以除去杂草.草甘膦市场越来越大.重新认识草甘膦对抗草甘膦植物和普通植物的伤害就变得非常必要.

Delannay X等[9]的研究表明，对抗草甘膦大豆喷施草甘膦对株型的快速生长无影响，不会导致显著的伤害.Elmore R W，Nelson K A等的研究表明[10-11]，按照说明书使用对抗草甘膦大豆施用草甘膦，不会影响生长和产量.Kelly A等[12]的研究表明，草甘膦对抗草甘膦转基因大豆的叶面积指数、生殖生长、营养生长以及产量都不会有明显影响.然而，这些研究都停留在宏观水平，喷施草甘膦后，关于抗草甘膦大豆的叶片表皮细胞的变化，开口气孔个数变化及气孔结构的变化的研究，国内外还未见有报道.

本研究以抗草甘膦大豆和东农42为材料，喷施草甘膦，利用扫描电镜来研究草甘膦对东农42和抗草甘膦大豆的不同作用.本研究引入了草甘膦对植物的超微结构影响的研究，为草甘膦的作用机理研究拓展新的视野.

1 材料与方法

1.1 试验材料

东农42(Glycinemax(L.) Merr. Dongnong 42)由东农大豆研究所提供.转基因大豆GTS 40-3-2(Glycinemax(L.) Merr.GTS 40-3-2)由东农转基因作物检测中心提供.草甘膦为41%的草甘膦异丙铵盐.

1.2 田间喷药

大豆种植，采用小区对比相邻种植设计.行距62 cm，株距12 cm，行长50 m.大豆处于营养生长，第3到第5复叶期，即V3～V5期，喷施草甘膦.分别在第1次喷药前(0 d)和喷药后的第1、2、3、4、5、6、7 d，14 d，21 d，28 d，42 d取样.设4个处理：东农42不喷药、东农42喷药、GTS 40-3-2不喷药、GTS 40-3-2喷药.根据说明书按1∶100喷施草甘膦.

1.3 取样

取下叶片，置于冰盒中，带回实验室.叶片取材说明：取3次，每次都取第3片三重复叶的中间一片得第2叶脉与第3叶脉中间部位.

1.4 扫描电镜观察

扫描电镜处理过程包括：取材、固定、冲洗、脱水、置换、用ES-2030(HITACHI)型冷冻干燥仪对样品进行干燥、粘样、在E-1010(HITACHI)型离子溅射镀膜仪镀膜、将处理好的样品放在的S-3400扫描电镜(日立公司)下观察.

2 结果与分析

2.1 东农42喷施草甘膦后叶片的扫描电镜观察

喷施草甘膦后东农42的叶片上表皮的变化如图1所示.

在喷药后第4天时，东农42的上表皮细胞出现变形(图1-17).在喷药后第6天和第7天时，上表皮细胞变形严重，并下陷明显(图1-25，29).在喷药后第1天时，上表皮细胞的气孔，有部分气孔变形(图1-6)，到喷药后第4天时气孔器的内壁明显出现皱缩的迹象(图1-18)，这种皱缩随喷药天数的增加，其变形程度加大(图1-22，26，30).

图1 喷施草甘膦后上表皮细胞的扫描电镜观察图1-1 未喷施草甘膦的东农42的叶片的上表皮，图1-2 未喷施草甘膦的东农42的叶片的上表皮的气孔，图1-3 未喷施草甘膦的抗草甘膦大豆的叶片的上表皮，图1-4 未喷施草甘膦的抗草甘膦大豆的叶片的上表皮的气孔图1-5，9，13，17，21，25，29 喷施草甘膦1～7 d后东农42的叶片的上表皮的变化，图1-6，10，14，18，22，26，30 喷施草甘膦1～7 d后东农42的叶片的上表皮气孔的变化.图1-7，11，15，19，23，27，31 喷施草甘膦1～7 d后抗草甘膦大豆的叶片的上表皮的变化，图1-8，12，16，20，24，28，32 喷施草甘膦1～7 d后抗草甘膦大豆的叶片的上表皮气孔的变化.Fig.1 Epidermal cell change after spraying glyphosate under scanning electron microscopyFig.1-1 Dongnong 42 leaves upper epidermis with no spraying，Fig.1-2 Dongnong 42 leaves stomata with no spraying，Fig.1-3 Glyphosate resistant soybean upper epidermis with no spraying，Fig.1-4 Glyphosate resistant soybean leaves stomata with no spraying，Fig. 1-5，9，13，17，21，25，29 Dongnong 42 leaves upper epidermis change at 1～7 days after spraying， Fig. 1-6，10，14，18，22，26，30 Dongnong 42 leaves stomata change at 1～7 days after spraying，Fig. 1-7，11，15，19，23，27，31 Glyphosate resistant soybean leaves upper epidermis change at 1～7 days after spraying，Fig. 1-8，12，16，20，24，28，32 Glyphosate resistant soybean leaves stomata change at 1～7 days after spraying.

2.2 喷施草甘膦后的抗草甘膦大豆叶片的扫描电镜观察

图1、图2显示了抗草甘膦大豆叶片的上表皮在喷施草甘膦后的变化.

图2 喷施草甘膦后14，21，28，42 d抗草甘膦大豆叶片的上表皮的扫描电镜观察图2-1，3，5，7 喷施草甘膦14，21，28，42 d后抗草甘膦大豆的叶片的上表皮的变化，图2-2，4，6，8 喷施草甘膦14，21，28，42 d后抗草甘膦大豆的叶片的上表皮的气孔的变化.Fig.2 Glyphosate resistant soybean leaves epidermal change after spraying 14，21，28，42 days under scanning electron microscopy Fig.2-1，3，5，7 Glyphosate resistant soybean upper epidermis change at 14，21，28，42 days after spraying，Fig.2-2，4，6，8 Glyphosate resistant soybean leaves stomata change at 14，21，28，42 days after spraying.

在喷药后的42 d内，抗草甘膦大豆叶片的上表皮细胞变化不明显(图1，图2).

抗草甘膦大豆的上表皮的气孔则有一定程度变化，在喷药后的第1天到第4天出现了气孔器内壁的明显变形(图1-8，12，16，20)，但到第5天及以后(图1-24)就未发现如此明显的变形(图1，图2).

2.3 扫描电镜下开口气孔个数的变化

从图1可以看出，东农42叶片在喷药后1 d急剧下降，到第2天有所恢复，但此后又进一步减少.抗草甘膦大豆的上表皮的气孔开口数在喷药后第1、2天有所下降，但到第3天有所恢复，到第4、5天又减少，到第6天后逐渐恢复，接近对照.

图3 喷药后上表皮气孔开口数的变化Fig.3 Change of the number of epicuticle opening stomata after spraying

3 讨论

内吸性是草甘膦的特点之一，在喷施后，草甘膦将经植物表皮和气孔进入植物体内[13]，进而影响植物的代谢.而表皮细胞作为草甘膦进入植物体的必经途径，非常容易受到草甘膦的作用，同时植物的表皮细胞还与植物代谢息息相关.因此，研究草甘膦对大豆叶片表皮细胞的变化的研究是非常必要的.

在扫描电子显微镜下，可以观察到大豆叶片的表皮细胞、气孔的变化.草甘膦对东农42的表皮细胞及气孔的作用是毁灭性的，但对GTS 40-3-2的表皮细胞及气孔作用中表现出的变化，是一个先发生变化而后逐渐恢复的过程.这与草甘膦对大豆叶肉细胞的超微结构及生化指标的影响相一致[14].东农42的表皮细胞及气孔在施草甘膦后的前期的变化，非常可能是草甘膦及其辅剂的物理作用所致，而后来的变化，则是由于草甘膦抑制莽草酸途径，影响芳香族氨基酸的合成所致.而抗草甘膦大豆GTS 40-3-2的表皮细胞及气孔的变化，其原因则比较复杂，包括：草甘膦作为一种物理过程对细胞的损害，例如对气孔导度，叶面温度，渗透压等的影响；对本身敏感EPSPS的短时间抑制；草甘膦对叶绿素合成的抑制等.大豆表皮细胞及气孔，随着草甘膦被吸收以及叶片的自身发育等因素的变化，其影响就逐渐消失.

虽然抗草甘膦大豆的叶片表皮细胞经过一定时间会恢复，但最终结果表现为大豆成熟期的短暂延迟，如果大豆经历了这个时期仍可成熟，就像Nelson K A等[11]的研究，不会影响生长和产量，否则，在引入或培育抗草甘膦大豆时，就必须考虑到原始大豆品种的成熟期，而且还必须考虑到喷施草甘膦对它的影响.

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