烟梗废料固态发酵生产苏云金芽孢杆菌的适宜条件筛选

杜雷，赵高岭，席宇，臧晓静，朱大恒

郑州大学生物工程系，郑州高新技术产业开发区科学大道100号450001

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是目前世界上应用最为广泛的杀虫微生物，其发酵方法主要有液体深层发酵和固体浅盘发酵［1］。目前大多数厂家使用的是液体深层发酵，但液体发酵需要昂贵的设备，浓缩和干燥耗能大，成本高，从而影响了生物农药的推广和应用。固体发酵作为苏云金芽孢杆菌工业发酵的方法之一，与液体发酵相比在生产中逐渐体现出其优势，如废水、废渣少，环境污染少，能源消耗量低，工艺设备和技术较简单，投资低，并且产物浓度高，产品易保存，便于包装和运输［2］。烟梗是烟草工业的副产物，我国每年约有数10万t烟梗废弃物被弃置浪费［3］。目前主要集中于打叶复烤厂内，不仅占用大量的仓库还需专人管理，如何对其充分利用已成为企业的迫切需求。目前对烟梗的利用方法主要是制造梗丝和烟草薄片用于卷烟配方中，也有从烟梗中提取烟碱、茄尼醇、烟酸、果胶、植物蛋白等成分［4］的探索研究，但这些方法的利用量不大，每年仍有大量烟梗被废弃，造成自然资源的浪费。烟梗中含有丰富的有机碳、氮和无机盐，是很好的发酵培养基质［5］。目前用于苏云金芽孢杆菌固态发酵的原料主要是农副产品，大量生产相对成本比较高。张怡等［6］将经处理后的废烟叶作为原料与麸皮混合作为载体，探索了固态发酵法培养苏云金芽孢杆菌的方法，但直接用烟梗为原料固态培养苏云金芽孢杆菌的研究尚未见报道。为此，以烟梗为主要发酵原料，对培养基营养成分配比和发酵条件进行了优化，旨在探讨利用烟梗采用固态发酵法生产苏云金芽孢杆菌的可行性，以降低苏云金芽孢杆菌的生产成本，并为烟梗废料的综合利用开辟新途径。

1 材料与方法

1.1 试验材料

菌种：苏云金芽孢杆菌HD-1，商业菌种，本实验室保存。烟梗由天昌国际烟草有限公司提供。

1.2 培养基

斜面培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化钠20 g，琼脂20 g，水1000 mL；液体种子培养基：不加琼脂即可，在121℃灭菌20 min后备用。

筛选固体培养基：烟梗（粉碎过16目筛），玉米粉，豆饼粉（购于市场），蛋白胨（郑州创生），酵母粉（英国Oxoid公司），KH2PO4，MgSO4·7H2O，FeSO4，MnSO4（天津市科密欧化学试剂开发中心）。

1.3 培养基成分的优化设计

碳、氮源配比的优化：以烟梗为主要碳源，以蛋白胨、酵母粉、豆饼粉和玉米粉为补充氮源［7］，每个因素选高低4个水平进行正交试验设计［8］，应用L16（45）正交表对各组分进行优化试验，考察不同培养基组分对活芽孢数的影响。各因素水平见表1。

无机盐优化：确定好碳、氮源配比后，将KH2PO4，FeSO4，（NH4）2SO4和MgSO4·7H2O 4个因素作为培养基无机盐成分，每个因素选3个水平设计正交试验，应用L9（34）正交表对无机盐组分进行优化试验。各因素水平见表2。

表1 培养基的碳、氮源正交试验水平Tab.1 Level of carbon and nitrogen resourcein medium（g）

表2 培养基的无机盐正交试验水平Tab.2 Level of inorganic saltin medium （g）

1.4 三角瓶发酵培养

按照正交试验设计，将各种配比的培养基配置好后装入250 mL的三角瓶，加水后摇匀，灭菌接种后培养。培养过程中培养条件先按初始含水率60%，接种量5%，初始pH7.0，放入30℃培养箱培养，定时翻动摇匀培养基，并取样涂片、染色观察，至芽孢脱落率达到30%时终止培养，测其活芽孢数。

1.5 培养基条件的优化设计

确定最优培养基营养成分组合后，用单因素试验方法，分别对接种量，培养基的初始pH，初始含水率进行优化。

1.6 分析方法

采用孔雀绿及沙黄染色法观察芽孢的形成，平板菌计数法［9］对固体培养芽孢计数。

2 结果与讨论

2.1 碳、氮源的优化结果

根据表l正交试验设计对HD-1菌株进行固体发酵，结果表明（表3）：由极差R可以看出，各因素对产孢量的影响为：烟草废料＞酵母粉＞玉米粉＞豆饼粉＞蛋白胨；烟梗固态发酵培养基的最佳组合为：烟梗15 g，酵母粉0.2 g，蛋白胨0.2 g，黄豆饼粉1 g，玉米粉0.5 g。烟梗为菌体生长提供碳源，又是菌体生长的载体，且其含有丰富的糖类，很适宜作为发酵材料。由表3可以看出，以蛋白胨为氮源对产芽孢数量影响不大，但以酵母粉、豆饼粉、玉米粉为补充氮源时影响较大，它们与烟梗混合，大大改善了培养基的发酵性能，提高了芽孢产率。

表3 L16（45）碳氮源优化正交试验设计与结果Tab.3 Designandresulto for thogonal test for optimizingcarbonandnitrogenresource

2.2 无机盐优化试验

在菌体的生长中，许多矿质元素都直接参与细胞的组成、能量的转移、维持原生质的胶质体系和渗透性，对生长起着重要的作用。其中Mg2+，Mn2+，Fe2+，Zn2+，Ca2+的适当浓度对营养细胞的生长、芽孢和伴孢晶体的形成有明显刺激作用［8］。由表4可以看出，KH2PO4的影响最显著，其次是MgSO4·7H2O，MnSO4和FeSO4的影响较小。最佳无机盐配比为KH2PO40.03 g，FeSO40.02 g，MnSO40.03 g和MgSO4·7H2O 0.04 g。

2.3 接种量对芽孢形成的影响

接种量是与培养基利用率直接相关的参数。接种量大时尽管可以使芽孢生长快、周期短，但后期可能因缺乏营养而无法达到较高的芽孢数；而接种量太小时不仅对营养利用不充分，且发酵周期可能延长，染菌几率提高［10］。在确定最佳培养基组成成分后，将其接种量设为4%，5%，6%，7%和8%5个因素水平进行试验，结果见图1。由图1可知，接种量在6%时产孢量最高，可达9.0×1010CFU/g。

表4 无机盐优化正交试验设计与结果Tab.4 Design and result of orthogonal test for optimizing inorganic salt

图1 接种量对芽孢数的影响Fig.1 Effect of the inoculum size on spores formation

2.4 初始含水率对芽孢形成的影响

初始含水率对芽孢形成有较大的影响。水分适宜则菌体生长好，产品毒力效价高；水分过多则物料通气性差，菌体得不到充足的氧气，生长受到限制；水分偏少时，菌体吸收不到水分和溶解在水中的营养，生长也受到限制［11-12］。本试验将初始含水率设为55%，60%，65%，70%和75%5个因素水平进行试验，结果见图2。由图2可知，当初始含水率为65%时，芽孢数量最高，可达到8.5×1010CFU/g。

2.5 初始pH对芽孢形成的影响

培养基的pH值不仅影响芽孢的萌发，还影响芽孢的形成。本试验将初始pH设为5.5，6.5，7.5，8.5和9.5 5个因素水平进行试验，结果见图3。由图3可知，初始pH为7.5时，芽孢数最多，可达到9.5×1010CFU/g。当pH为5.5和9.5时，芽孢数明显减少，这是因为苏云金芽孢杆菌在芽孢形成的初始阶段，菌体合成一种胞外蛋白酶参与伴孢晶体的蛋白质转化合成过程，而这种酶的合成与酶活性最适pH值为中性，pH值在6.5以下或9.1以上时酶活性急剧下降，丧失形成这种酶的变异菌株既不能形成芽孢，也不能形成晶体［13］。

图2 初始含水率对芽孢数量的影响Fig.2 Effect of initial moisture content on spore formation

图3 初始pH对芽孢数量的影响Fig.3 Effect of initial pH on spore formation

3 小结

通过正交试验设计，确定了固态发酵培养苏云金芽孢杆菌的最佳培养基组成，其中包括烟梗废料88.13%，酵母粉1.17%，蛋白胨1.17%，豆饼粉5.88%，玉米粉2.93%，KH2PO40.18%，MgSO4·7H2O 0.24%，FeSO40.12%，MnSO40.18%。补充培养基营养成分和无机盐对苏云金芽孢杆菌的生长和芽孢产量有较大促进作用。

通过单因素试验确定了最佳培养条件为：接种量为6%，初始含水率65%，初始pH7.5，在此发酵条件下苏云金芽孢杆菌HD-1的芽孢数可稳定在9.5×1010CFU/g，达到了每克培养物含芽孢数100亿个以上的国家标准［14］。

本试验证实了以烟梗作为培养基进行固态发酵生产生物农药的可行性，与液体发酵法相比［15］，其产孢量大大提高，且在生产中更易于推广应用。

［1］校逸，胡潇涵，陈建帮，等.Bt生物农药固态发酵研究进展［J］.金属世界，2009（2）：99-102.

［2］方苹，韦萍，范伟平，等.苏云金杆菌固体发酵工艺研究［J］.南京工业大学学报，2002，24（6）：84-87.

［3］白聚川，董占能，张皓东.烟草废弃物的综合利用［J］.中国野生植物资源，2007，26（5）：41-43.

［4］艾心灵，王洪新，朱松.烟草中绿原酸、烟碱和茄尼醇的超声波辅助提取［J］.烟草科技，2007（4）：45-48.

［5］王月侠，葛菩礼，贾涛，等.烟梗化学组成的分析［J］.烟草科技，1996（3）：16-17.

［6］张怡，杨天雪，秦旌，等.废次烟草作为载体在固态发酵体系中的综合利用［J］.烟草科技，2000（7）：5-7.

［7］卢新民，陈若霞，叶恭银，等.苏云金杆菌菌株YJ-2000生长和伴孢晶体形成的适宜培养条件［J］.浙江农业学报，2009，21（1）：6-10.

［8］李春喜，王志和，王文林.生物统计学（第2版）［M］.北京：科学出版社，2000：149-156.

［9］陈聪.苏云金芽孢杆菌发酵培养基配方的优化［D］.福建农林大学，2004.

［10］陶玉贵.生物农药固态发酵条件的研究［J］.安徽师范大学报，2001，24（1）：31-34.

［11］弓爱君，孙翠霞，邱丽娜，等.Bt生物农药［M］.北京：化学工业出版社，2006：93-98.

［12］KaurS.Molecularapproachestowardsdevelopmentof novelBacillusThuringiensisbiopesticides［J］.WorldJ Microbiol&Biotech，2000（16）：781-793.

［13］翟兴礼.苏云金芽孢杆菌四个亚种对温度和pH值的耐受性［J］.商丘师范学院学报，2009，6（25）：103-105.

［14］喻子牛.苏云金杆菌［M］.北京：科学出版社，1990.

［15］李超，杜雷，席宇，等.烟梗废料液态发酵生产苏云金芽孢杆菌的适宜条件筛选［J］.烟草科技，2011（3）：69-71.