16S rRNA二级结构分析在微生物分类鉴定中的应用*

赵婷，李辉，程池

(中国食品发酵工业研究院，中国工业微生物菌种保藏管理中心，北京，100027)

二级结构相比核苷酸一级序列具有更高的稳定性，对于维系生物功能性极为重要。近年来，16S rRNA二级结构图形分析用于微生物分类鉴定及系统发育分析逐步发展起来。枯草芽孢杆菌(B．subtilis)和地衣芽孢杆菌(B．lichenformis)广泛应用于工业生产，产生多种蛋白酶、淀粉酶、麦芽糖酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶等［1－2］。枯草芽孢杆菌(B．subtilis)的某些株为传统发酵食品纳豆的生产菌株。但是由于这两个菌种16S rRNA基因同源性很高［3］，表型特征极其相似［4］，常规鉴定方法较难区分，本文通过16S rRNA二级结构图形分析比较，评估该方法用于区分枯草芽孢杆菌(B．subtilis)和地衣芽孢杆菌(B．lichenformis)的可行性。

1 概念

16S rRNA二级结构是指rRNA序列通过自身回折形成碱基配对的茎区(stem)以及不配对的发卡环(hairpin loop)、突环 (bulge loop)、内环 (interior loop)、多支分环(multi-branched loop)等结构。碱基配对的茎区对于二级结构的稳定性起到重要作用，而各种环区的形成会破坏结构稳定性。

1981年，Woese等［5］以Escherichia coli的 16S rRNA序列为基础，根据化学修饰、蛋白结合、酶切片段等试验数据，初步推断并描述了16S rRNA二级结构模型。1983年，Woese等［6］比较分析了真细菌域、古细菌域、真核生物域150余个物种的16S rRNA序列，论述了三域生物16S rRNA二级结构与能量及功能之间的关系，提出序列比较方法是预测假设结构的有力工具。1993年，Neefs等［7］完善和改进了Woese提出的模型，阐述了真细菌、古细菌、真核生物的核糖体小亚基的二级结构模式图及之间的区别。奥斯汀TEXAS大学Gutell实验室建立的Comparative RNA Web(CRW)Site 数据库［8－9］，包含有最近更新的参照菌株E．coliJ01695的16S rRNA二级结构模型，同时包括rRNA二级结构模型的演变历程、新旧结构模型的比较信息、核苷酸序列及结构数据等。rRNA二级结构模型的建立揭示了微生物类群中核糖体结构保守性一般大于序列保守性，并且二级结构的稳定性与功能性紧密相关。

RNA二级结构预测方法主要包括最小自由能法和比较序列分析法。最小自由能算法是Zuker［10］在1981年提出的，发展至今已相当成熟，使用方便，预测成功率高，基于RNA structure软件预测。比较序列分析法，由 Mathias［11］和 Lowe［12］于 1998 年和 1997年分别提出，比较序列分析法可靠性较强，但其预测结果强烈依赖于多序列比对的结果，操作繁复，工作量大。目前流行的做法是把两者结合起来使用。

2 国内外研究进展

16S rRNA二级结构在微生物菌种分类及系统发育分析中有一定程度的应用，Wisotzkey等［13］在1992年根据16S rRNA部分同源区段的二级结构和脂肪酸类型从芽孢杆菌属(Bacillus)属划分出一个新属:脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus);1997年，MORI等［14］比较分析了Lactobacillus casei及其相关种16S rRNA 69位点至100位点的二级结构，结果表明该区段存在种水平差异;2003年，郭春雷等［15］预测并比较了栖热菌属(Thermus)16S rRNA部分区段的二级结构，结果表明在种水平存在内环、发卡环间碱基对数目的差异;2006年，陈国忠等［16］分析比较了姜氏菌属(Jiangella)及相关属16S rRNA可变区二级结构图形差异，结果表明在9个可变区二级结构中茎的长度、环的数目和类型、茎的碱基对、环内部碱基均有不同，认为该方法可以区分属以上水平原核生物。2006年，姜怡等［17］分析比较了闫氏菌科(Yaniaceae)16S rRNA可变区二级结构，提出在9个可变区中，有2个以上不同的结构单元可以定为新科，有1个不同的结构单元可以定为新属。除16S rRNA外，其他RNA二级结构分子标志也有应用，如2004年，Hong等［18］分析比较了灵芝属(Ganoderma)线粒体小亚基V1、V4、V5、V6、V9可变区rRNA二级结构，认为二级结构用于分析灵芝属系统发育线性关系是一个有力的工具;2007年，刘超洋等［19］分析了子囊菌门部分类群的18S rRNA二级结构特征，认为二级结构能更清晰地体现子囊果的演化历程。

3 枯草芽孢杆菌(B．subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.lichenformis)的16S rRNA可变区二级结构比较

从NCBI GenBank数据库获取研究菌株序列信息，运用Clustalx 1.83及RNA structure 4.6分析比较枯草芽孢杆菌(B．subtilis)ATCC 6051T(GenBank登录号:AB271744)和地衣芽孢杆菌(B.lichenformis)ATCC 14580T(GenBank登录号:CP000002)的 16S rRNA可变区二级结构，表1显示枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.lichenformis)16S rRNA保守区序列位点差异，图1～图3显示枯草芽孢杆菌(B．subtilis)和地衣芽孢杆菌(B．lichenformis)16S rRNA可变区二级结构图形。

表1 枯草芽孢杆菌(B．subtilis)和地衣芽孢杆菌(B．lichenformis)16S rRNA保守区序列位点差异

3.1 V2可变区180－230区段50nt 16S rRNA二级结构比较

B．subtilis由2个茎、2个发卡环、1个突环组成，B．lichenformis由3个茎、2个发卡环、1个内环、1个突环组成，两者结构明显不同，关键碱基第4位碱基B．subtilis为 G，B．lichenformis为 C，该碱基的不同引起了两者结构的改变，其他 8、27、43、44、45 位碱基的不同没有引起两者结构的改变。

图1 枯草芽孢杆菌(B．subtilis)和地衣芽孢杆菌(B．lichenformis)V2可变区的二级结构

3.2 V4可变区580－630区段50nt 16S rRNA二级结构比较

B.subtilis由3个茎、2个内环、1个发卡环、1个突环组成，B.lichenformis由3个茎、2个内环、1个发卡环组成，两者结构明显不同，关键碱基第12位碱基B.subtilis为 G，B.lichenformis为 C，第 15位碱基B.subtilis为 U，B．lichenformis为 G，这2 个碱基的不同引起了两者结构的改变。

图2 枯草芽孢杆菌(B．subtilis)和地衣芽孢杆菌(B．lichenformis)V4可变区的二级结构

3.3 V9可变区1430－1480区段50nt 16S rRNA二级结构比较

B．subtilis由4个茎、2个内环、2个发卡环、1个突环组成，B．lichenformis由5个茎、3个内环、2个发卡环、1个突环组成，两者结构明显不同，关键碱基第41位碱基B．subtilis为 A，B．lichenformis该碱基缺失，该碱基的缺失引起了两者结构的巨大变化。

图3 枯草芽孢杆菌(B．subtilis)和地衣芽孢杆菌(B．lichenformis)V9可变区的二级结构

综上分析，枯草芽孢杆菌(B．subtilis)和地衣芽孢杆菌(B．lichenformis)16S rRNA二级结构在V2、V4、V9共3个可变区有明显不同，表明16S rRNA二级结构分析可以用于两者种水平鉴别。

4 结语

16S rRNA二级结构分析(图形结构差异)，基于现有的海量核酸序列信息，提供更多的系统发育信息，为微生物菌种分类提供了有一个有意义的分子指征。随着更多更准确的预测方法被开发出来，更多种属样本的验证数据，更多因素的评估，如假结、细胞组成、碱基修饰、转录过程等，16S rRNA二级结构也会越来越广泛地用于系统分类和进化的研究。如2007年，Huang等［20］研究了包含假结的rRNA二级结构预测分析，Pfold等［21］试图应用将系统进化树来指导rRNA二级结构预测并获得了突破。

枯草芽孢杆菌(B．subtilis)ATCC 6051T和地衣芽孢杆菌(B．lichenformis)ATCC 14580T16S rRNA共有28个保守差异碱基位点，本文尝试了所有差异位点的二级结构，只有文中选取的3个区段二级结构有明显差异。16S rRNA二级结构分析可以在种水平对枯草芽孢杆菌(B．subtilis)和地衣芽孢杆菌(B．lichenformis)进行鉴别，期望为广大生产企业及检测检验机构对菌种的使用、标识、检测、鉴定提供理论及技术依据。

［1］ 饲料添加剂品种目录.中华人民共和国农业部公告第1126号，2008.

［2］ NY/T 1461－2007饲料微生物添加剂地衣芽孢杆菌.

［3］ Fox G E，Wisotzkey J D，Jurtshuk P．How close is close:16S rRNA sequence identity may not be sufficient to guarantee species identity［J］．Int J Syst Bacteriol，1992，42:166－170.

［4］ 东秀珠，蔡妙英．常见细菌系统鉴定手册［M］．北京:科学出版社，2001:62－63.

［5］ Noller H F，Woese C R．Secondary structure of 16S ribosomal RNA［J］．Science，1981，212(4):403 － 411.

［6］ Woese C R，Gutell R，Noller H F，et al．Detailed analysis of the higher-order structrue of 16S-like ribosomal ribonucleic acids［J］．Microbiol Rev，1983，47(4):621 －669.

［7］ Neefs J M，Peer Y V D，Rijk D P，et al．Compilation of small ribosomal subunit RNA structure［J］．Nucleic Acids Res，1993，21(13):3 025 －3 049.

［8］ Comparative RNA Web Site:(http://www．rna．ccbb．utexas．edu).

［9］ Cannone J J，Subramanian S，Schnare M N，et al．The comparative RNA web(CRW)site:an online database of comparative sequence and structure information for ribosomal，intron，and other RNAs［J］．BMC Bioinformatics，2002，3(1):2.

［10］ Zuker M，Stiegler P．Optimal computer folding of large RNA sequences using thermodynamics and auxiliary information［J］．Nucleic Acids Res，1981，9(1):133 －148.

［11］ Mathias S，Carsten H，Melissa B，et al．Compilation of tRNA sequences and sequences of tRNA gene［J］．Nucleic Acids Research，1998，26(1):148 －153.

［12］ Lowe T M，Eddy S R．tRNAscan-SE:A program for improved detection of transfer RNA genes in genomic sequence［J］．Nucleic Acids Research，1997，25(5):955 －964.

［13］ Wisotzkey J D，Jurtshuk P J，Fox G E，et al．Comparative sequence analyses on the 16S rRNA(rDNA)ofBacillus acidocaldarius，Bacillus acidoterrestris，andBacillus cyclohepatanicusand proposal for creation of a new genus，Alicyclobacillusgen．nov［J］．Int J Syst Bacteriol，1992，42:263－269.

［14］ Mori K，Yamazaki K，Ishiyama T，et al．Comparative Sequence Analyses of the Genes Coding for 16S rRNA ofLactobacilluscasei-Related Taxa［J］．Int J Syst Bacteriol，1997，47:54 －57.

［15］ Guo C L，Wang T，Zhu W，et al．The phylotype of thermos from the Rehai geothermal area，Tengching，China［J］．J Microbiol，2003，41(2):152 －156.

［16］ 陈国忠，姜怡，唐蜀昆，等．16S rRNA二级结构可变区图形分析在放线菌分类中的应用［J］．微生物学通报，2006，33(2):184 －187.

［17］ 姜怡，唐蜀昆，徐丽华，等．阎氏菌科的16S rRNA可变区二级结构分析［J］．微生物学通报，2006，33(5):176－182.

［18］ Soon G H，Hack S J．Phylogenetic analysis of Ganoderma based on nearly complete mitochondrial small-subunit ribosomal DNA sequences［J］．Mycologia，2004，96(4):742－755.

［19］ 刘超洋，庄文颖．rRNA二级结构序列用于真菌系统学研究的方法初探［J］．菌物学报，2007，26(1):22 －31.

［20］ Huang X L，Hesham A．High sensitivity RNA pseudoknot prediction［J］．Nucleic Acids Research，2007，35(2):656－663.

［21］ Knudsen B，Pfold H J．RNA secondary structure prediction using stochastic context-free grammars［J］．Nucleic Acids Research，2003，31(13):3 423 －3 428.