黄伞子实体多糖PAP2的分离纯化及其结构初步鉴定

聂永心，姜红霞，苏延友，朱常香，温孚江

1(山东农业大学作物生物学国家重点实验室，山东泰安，271018)2(泰山医学院，山东泰安，271016)

真菌多糖是自然界中存在种类较多、生物活性较高的一类活性多糖，近年来研究发现，真菌多糖具有免疫增强与调节、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老等广泛的生物活性［1－2］，是公认的安全低毒活性物质，成为国内外专家学者关注的焦点。数据显示，黄伞多糖具有抑菌［3］、抗氧化［4］、抗肿瘤［5－6］等广泛的生物活性。目前有关黄伞子实体多糖的研究很少，对其多糖的分离纯化及结构分析方面还未见有报道。本研究主要对黄伞子实体多糖进行提取与纯化，通过高效液相色谱(HPLC)、高效凝胶渗透色谱(HPGPC)、红外光谱(IR)、核磁共振(NMR)等方法对其结构进行初步鉴定，以期为进一步研究黄伞子实体多糖的药理作用及构效关系提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄伞子实体，由泰山医学院苏延友教授培育提供;单糖标准品，上海国药集团，三氟乙酸(TFA)，Sigma公司，Dextran系列标准品，GE公司产品;无水乙醇、甲醇、氯仿、正丁醇等所用试剂均为国产分析纯。

1.2 主要仪器与设备

KTA Purifier纯化系统，美国GE公司;S-3100紫外分光光度计，韩国SCINCO公司;Agilent 1200高效液相色谱仪(配备1200 serials蒸发光散射检测器)，美国安捷伦公司;Nicolet380傅立叶变换红外光谱仪，美国热电集团;AVANCE 600傅立叶变换核磁共振波谱仪，瑞士布鲁克公司

1.3 方法

1.3.1 黄伞子实体多糖的提取纯化

称取黄伞子实体100 g，加入1∶1的乙醇-乙醚混合液，于65℃水浴回流脱脂2 h，残渣中加适量水(水料比20∶1)，100℃水浴提取3次，每次4 h，过滤，将滤液合并，浓缩，加入氯仿-正丁醇(4∶1)，充分振荡30 min，5 000 r/min离心20 min，取上层水相重复除蛋白质8次，水相用1 mol/L的HCl调节pH至4.0，加入1%的活性炭，50℃脱色30 min，离心除去活性碳，重复2次，上清液过滤，加入5倍体积的无水乙醇，4℃静置过夜，离心，加适量水溶解，真空冷冻干燥得灰白色絮状黄伞子实体粗多糖(PAP)。

将PAP过DEAE-Sepharose Fast Flow柱(1.6 cm×10 cm)，先以蒸馏水洗脱，再用0～2 mol/L的NaCl进行梯度洗脱，洗脱液3 mL/管收集，苯酚硫酸法A490检测，合并相同流分，浓缩，透析，冷冻干燥得PAP1和PAP2两个组分，PAP2为主要组分。PAP2再过SuperdexTM200柱(1 cm×30 cm)，蒸馏水洗脱，1 mL/管收集，苯酚硫酸法A490检测，合并相同流分，浓缩，透析，冷冻干燥，得白色絮状黄伞子实体多糖(PAP2)。

1.3.2 黄伞子实体多糖PAP2的均一性和分子质量测定

采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)对PAP2进行均一性及分子质量的测定。色谱条件:色谱柱为TSK-G4000PWXL 柱(7.8 mm ×300 mm，10 μm)，流动相为双重纯蒸水;流速1 mL/min;进样量20 μL;柱温40℃;蒸发光散射检测器(ELSD)检测。

1.3.3 HPLC-ELSD法测定黄伞子实体多糖PAP2的单糖组成

(1)色谱条件:Prevail Carbohydrate ES柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，柱温 25℃;流动相为乙腈-水(85∶15)，流速0.8 mL/min;ELSD检测器温度80℃，辅助气(N2)压力3.5 bar，增益(gain)为6。

(2)样品处理:称取5 mg黄伞子实体多糖于安培瓶中，加入2 mol/L三氟乙酸(TFA)2 mL，110℃封管水解2 h，水解液减压浓缩至干，再加甲醇3 mL蒸干，重复3次，以除尽TFA。加少量水溶解，水解产物经0.45 μm微孔滤膜过滤，取滤液20 μL用于液相分析，与7种标准单糖对照品的色谱图比较确定单糖的种类和比例。

1.3.4 黄伞子实体多糖PAP2的红外光谱分析

称取5 mg黄伞子实体多糖PAP2与200 mg干燥的KBr粉末在研钵中研磨均匀，压片，上机在4000～400 cm－1内进行扫描。

1.3.5 黄伞子实体多糖PAP2的核磁共振波谱分析

取10 mg多糖PAP2溶于0.5 mL重水中，在核磁共振仪上进行1H NMR、13C NMR谱测定。

2 结果与分析

2.1 黄伞子实体多糖PAP2的分离纯化

黄伞子实体经热水提取、醇沉、Sevag脱蛋白及活性炭脱色得黄伞子实体粗多糖(PAP)，PAP经DEAESepharose Fast Flow离子交换柱分离得到2个组分(如图1A)，其中PAP2为主要组分;PAP2经SuperdexTM200凝胶柱进一步分离纯化得到1个组分(如图1B)，将洗脱液浓缩、透析、冷冻干燥得白色絮状多糖PAP2。

2.2 PAP2的均一性及分子质量测定

将系列葡聚糖(Dextran)标准品用超纯水配成质量体积分数为0.2%的溶液，按上述HPGPC色谱条件测定保留时间，与葡聚糖标准品分子质量对数作图得线性回归方程:lgMw=8.558 4－0.4849tR，r2=0.997。PAP2在HPGPC上得到一个单一对称峰(如图2所示)，表明其为均一组分。根据PAP2的保留时间，由回归方程计算得PAP2的平均分子质量为2.1 ×106u。

2.3 PAP2的单糖组成分析

黄伞子实体多糖水解产物的高效液相色谱分析结果如图4所示，与混合标准单糖的高效液相色谱图(图3)中各标准单糖的保留时间进行对照分析，发现在黄伞子实体纯化多糖PAP2水解产物中只有葡萄糖，表明其是由葡萄糖组成的均一多糖。本课题组前期研究表明黄伞子实体多糖(PAP)单糖组成中主要含有葡萄糖外，还含有少量木糖和甘露糖［7］，可能为其他多糖组分含有的单糖或游离的单糖。

图1 黄伞子实体多糖(PAP)的DEAE-Sepharose Fast Flow(A)与SuperdexTM 200(B)柱层析图

图2 黄伞子实体多糖纯化组分PAP2的HPSEC色谱图

图3 7种标准单糖的高效液相色谱图

图4 黄伞子实体多糖PAP2中单糖组分的高效液相色谱图

2.4 PAP2的红外光谱分析

PAP2红外光谱分析结果如图5所示，其中3 349.34 cm－1处的强吸收峰是－OH伸缩振动引起的吸收;2 921.86 cm－1为饱和C-H伸缩振动吸收;在1 641.74 cm－1的 峰 是 多 糖 水 合 振 动 吸 收 峰［8］;1 369.07 cm－1出现的峰是由于C－H变角振动引起的;1 150.42 cm－1、1 078.99 cm－1、1 022.77 cm－1三个峰为吡喃糖环特征吸收峰，是其糖苷键C－O－C的非对 称振 动峰［9］; 红 外光 谱在 860.82 cm－1、930.09 cm－1的吸收峰，为α型葡聚糖的振动光谱特征带［10］，761.44 cm－1的吸收峰表明存在葡萄吡喃糖残基，在1 730 cm－1左右没有吸收峰表明不含糖醛酸。红外分析结果表明PAP2是一种α－D-吡喃葡聚糖，与单糖组成分析结果一致。

图5 黄伞子实体多糖纯化组分PAP2的红外光谱图

2.5 PAP2的核磁共振波谱分析

黄伞子实体多糖PAP2的1H NMR如图6所示。在PAP2的1H NMR谱图中，异头质子的共振区域δ 4.6～5.5 ppm只存在一个异头氢的共振峰δ 5.403，说明PAP2只有一种单糖组成，这与单糖组成分析结果一致，其质子化学位移大于4.95，表明这些糖残基为 α 型吡喃糖［11］。

图6 黄伞子实体多糖纯化组分PAP2的1H NMR谱图(注:图中吸收峰从左到右依次为 5.403、4.835、4.531、4.518、4.216、3.962、3.845、3.765、3.651、3.648、3.641、3.628、3.621、3.557、3.546、3.537、3.526、3.500、3.484、3.420、3.339、3.232ppm)

图7 黄伞子实体多糖纯化组分PAP2的13C NMR谱图

黄伞子实体多糖PAP2的13C NMR谱如图7所示。在PAP2的13C NMR谱图中，低场区化学位移δ 99.652 ppm处的信号为葡萄糖残基的异头碳信号，由于化学位移小于δ 103，表明葡萄糖残基的构型为α吡喃型［12］，这与IR结果一致。在13C NMR谱中δ 99.652 ppm 处的位移，表明 C1 发生取代［13］;δ 76.543 ppm的信号表明糖链中存在C4位取代的葡萄糖残基;δ 69.21 ppm附近的化学位移为6位取代的碳信号［14］;δ 62.346 ppm 处的强吸收峰说明大部分葡萄糖的C6未发生取代;在δ 82.5 ppm附近没有吸收峰，表明C3没有发生取代。根据峰高比例大致可以看出黄伞子实体多糖PAP2的主链为1-4糖苷键，存在1-6糖苷键的支链。

3 结论

通过热水提取、sevag脱蛋白、活性炭脱色、柱层析等方法，首次从黄伞子实体中分离得到一种水溶性多糖组分PAP2，并对其结构进行了初步鉴定。经HPGPC、HPLC-ESLD、IR、NMR 等方法分析，确定黄伞子实体纯化多糖PAP2的分子质量约为2.1×106u，由α-D吡喃葡萄糖残基组成的葡聚糖，主链为1-4糖苷键，存在1-6糖苷键的支链。

［1］ Sun Y X，Wang S S，Li T B，et al．Purification，structure and immunobiological activity of a new water-soluble polysaccharide from the mycelium ofPolyporusalbicans(Imaz．)Teng［J］．Bioresour Technol，2008，99:900 －904.

［2］ Chen Y，Xie M Y，Nie S P，et al．Purification，composition analysis and antioxidant activity of a polysaccharide from the fruiting bodies of Ganoderma atrum［J］．Food Chem，2008，107:231–241.

［3］ Basaran Dulger．Antimicrobial activity of the macrofungus Pholiota adiposa［J］．Fitoterapia，2004，75:395 －397.

［4］ Deng P，Zhang G Q，Zhou B，et al．Extraction and in vitro antioxidant activity of intracellular polysaccharide by Pholiota adiposa SX －02［J］．J Biosci Bioeng，2011，111:50－54.

［5］ 蒋晓琴，丁晓明，刘海燕，等．黄伞粗多糖抗肿瘤及对荷瘤小鼠免疫功能影响的研究［J］．中国药师，2007，10(2):119－121.

［6］ 赵永勋，李克颖，张跃华．多脂鳞伞菌丝体多糖抗肿瘤活性研究［J］．食用菌学报，2007，14(2):49－51.

［7］ 聂永心，姜红霞，苏延友，等．黄伞子实体多糖的提取纯化及单糖组成分析［J］．食品与发酵工业，2010，36(4):198－200.

［8］ 张惟杰．糖复合物生化研究技术［M］.2版.杭州:浙江大学出版社，1999:196－197.

［9］ Zhao G，Kan J，Li Z，et al．Structural features and immunological activity of a polysaccharide from Dioscorea opposita Thunb roots［J］．Carbohydr Polym，2005，61:125 －131.

［10］ 周继国，刘刚，刘剑虹，等．毛头鬼伞的红外光谱研究［J］．光谱学与光谱分析，2008，2(2):321－323.

［11］ Wu Y L，Pan Y J，Sun C R．Isolation，purification and structural investigation of a water-soluble polysaccharide from Solanum lyratum Thunb［J］．Int J Biol Macromol，2005，36(4):241－245.

［12］ Gorin P A J．Carbon 13 nuclear magnetic resonance spectroscopy of polysaccharides［J］．Adv Carbodydr Chem Biochem，1981，38:13－39.

［13］ Peng Y F，Zhang L N，Zeng F B，et al．Structure and antitumor activities of the water-soluble polysaccharides from Ganoderma tsugae mycelium［J］．Carbohydr Polym，2005，59:385－392.

［14］ Bao X F，Wang X S，Dong Q，et al．Structural features of immunologically active polysaccharides from Ganoderma lucidum［J］．Phytochemistry，2002，59:175－181.