同株奇异变形杆菌存在不同生长状态

刘 蕾,刘艳霞,邓 渝,刘俊康

(中国人民解放军第三军医大学,重庆 400038)

人类正面临着内、外环境的挑战,微生态环境作为一种重要的内环境对人体健康影响巨大。生命活动的本质是生物与内外环境形成的生态系统的平衡过程,而疾病多由各种干扰宿主的因素过度作用导致生态失调引起。奇异变形杆菌(Proteus m irabilis,PM)是一种重要的致病菌,有迁徙生长现象,研究表明变形杆菌群集运动能力有助于其在泌尿道的定植[1],其分化成鞭毛密度较大的群集体细胞后,能促进细菌对宿主细胞的入侵能力[2],而环境因素的变化会影响细菌的生长增殖、菌体形态及鞭毛密度等,从而引起细菌侵袭能力的变化。本研究以奇异变形杆菌为对象,以呼吸酶活性指示剂2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)为指示,观察细菌生长速度及迁徙能力的变化情况,并通过革兰染色和鞭毛染色观察菌体形态和鞭毛形态的变化情况,揭示同株奇异变形杆菌存在不同的生长状态,可能是细菌对环境变化表现出的适应性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 奇异变形杆菌(Proteus m irabilis,PM)由第三军医大学生物波实验室保存。

1.1.2 LB指示培养基 胰蛋白胨1%,酵母提取物0.5%,NaCl 1%,各成分溶于蒸馏水,调pH至7.2～7.4,加入1.5%琼脂,高压灭菌,临用前加入TTC溶液(10%TTC◇0.4 mol/L琥珀酸钠◇生理盐水为1◇5◇4,过滤除菌)使终浓度为0.05%及0.1%葡萄糖,制成平板。

1.1.3 仪器 显微镜型号:OLY MPUS BX41;图像采集系统:OLY MPUS DP72 CCD;图像分析软件:DP2-BS W-E-V2.2。

1.2 方法

1.2.1 细菌接种 用无菌塑料环均匀蘸取奇异变形杆菌菌液,环形接种于LB指示培养基平板上,37℃恒温培养。待环形接种的奇异变形杆菌向环内及环外生长速度减慢且出现扇状面凸起时,用接种针分别取不同区域细菌点种于LB指示培养基平板上,由外至内分别标记为A、B和C,37℃恒温培养过夜,观察细菌生长速度、菌体形态及鞭毛形态。将第1次点种传代的细菌按照上述方法继续传代,依次标记为第2代、第3代等,观察各代之间细菌生长速度、菌体形态及鞭毛形态的变化情况。

1.2.2 革兰染色 取第4代奇异变形杆菌A、B和C生长环上最外沿的菌体涂片固定,草酸铵结晶紫染色1 min,自来水冲洗,加碘液覆盖涂面染色1 min,水洗,吸水纸吸去多余水分,加95%酒精数滴,轻轻摇动脱色,30 s后水洗,吸去多余水分,蕃红染色液(稀)染色10 s后,自来水冲洗,干燥,油镜下观察菌体形态并拍照记录。

1.2.3 鞭毛染色—改良Ryu法 取第4代奇异变形杆菌A、B和C生长环上最外沿的菌体,按照《全国临床检验操作规程》[3]方法进行鞭毛染色,油镜下观察菌体形态并拍照记录。

2 结果与分析

2.1 同株奇异变形杆菌出现不同生长状态

环形接种于LB指示培养基平板上的奇异变形杆菌,37℃恒温培养24 h后向环内及环外生长的速度减慢,44 h后向环内及环外均出现扇状面凸起,箭头标记处(图1)。用接种针分别蘸取环外凸起、环上及环内凸起区域的细菌点种于LB指示培养基平板上,依次标记为A、B和C,37℃恒温培养过夜,观察发现不同区域细菌生长速度及迁徙能力出现了明显差异,环上细菌生长环数最少且环间距最小,外环凸起的细菌生长环数及环间距次之,内环凸起的细菌生长环数最多且环间距最大(图2)。用接种针蘸取第1次点种传代细菌的A、B和C环外沿菌体,点种于LB指示培养基平板上继续传代,依次标记为第2代、第3代,直至第7代仍发现A、B和C环细菌生长速度及迁徙能力具有明显差异,且变化趋势与第1代细菌保持一致(图3),提示同株奇异变形杆菌生长速度及迁徙能力发生了变化,且这种变化可传递多代。

图1 环形接种44 h观察结果Fig.1 44 h after annular inoculation

图2 第1次点种传代不同区域细菌生长情况Fig.2 bacterium growth state in different regions after the first dibbling passage

2.2 不同区域细菌革兰染色结果

以第4代细菌为例,取A、B和C环外沿菌体进行革兰染色,观察发现A和C菌体多为长杆状或丝状体,其中C菌体比A略粗,而B菌体多为短杆状(图4)。

2.3 不同区域细菌鞭毛染色结果

以第4代细菌为例,取A、B和C环外沿菌体进行鞭毛染色,观察发现C菌体鞭毛数量最多且鞭毛形态较长,A菌体鞭毛数量和长度次之,B菌体鞭毛数量较少且鞭毛形态较短(图5)。

图3 点种传代第2～7代不同区域细菌生长情况Fig.3 bacterium growth state in different regions of the second to the seventh generation by dibbling passage

图4 第4代细菌不同区域菌体革兰染色情况(1 000×)Fig.4 Gram stain of bacterium in different regions of the fourth generation(1 000×)

图5 第4代细菌不同区域菌体鞭毛染色情况(1 000×)Fig.5 Flagellum stain of bacterium in different regions of the fourth generation(1 000×)

3 讨 论

本研究室前期实验发现,改变培养环境可影响奇异变形杆菌的集群生长模式,能快速、直观地反应环境对微生态系统的影响[2]。Howard C.Berg[4]研究发现鼠伤寒沙门氏菌在营养丰富的软琼脂表面菌体延长,鞭毛增多,而当琼脂表面干燥时,菌体鞭毛缩短。本研究中奇异变形杆菌培养44 h后,同株细菌的群运动模式、菌体形态、鞭毛数量及鞭毛形态均发生了变化,可能是因为长时间培养导致培养基水分、营养物质等含量发生了变化,从而诱变出不同生长状态的细菌,这种培养环境的变化起初抑制细菌的集群运动,长时间抑制又可诱变出迁移能力增强、菌体增长、鞭毛增多的菌体,诱变后的细菌在多次传代过程中仍能保持上述变化特性,提示环境因素变化可能使细菌产生可遗传的突变,对细菌的生长、增殖及侵袭能力有巨大的影响。但导致同株细菌出现不同生长状态的具体环境因素,如湿度、营养条件等因素还需进一步设计实验证明。

有研究报道微生物形态变化,如形成丝状体,是微生物自我保护、趋利避害、适应环境的一种体现。本研究中革兰染色发现迁徙生长较快的A环和C环细菌菌体增长,而迁徙生长最慢的B环细菌菌体多为短杆状,其中迁徙生长速度最快的C环细菌菌体最粗,提示细菌生长增殖活力与菌体形态密切相关,可能是细菌适应环境生长的一种表现形式。鞭毛染色观察发现,鞭毛数量、长度与细菌的迁徙速率呈正相关,提示细菌生长增殖活力还与鞭毛的数量和形态密切相关。由于奇异变形杆菌鞭毛形态和迁徙能力可直接影响其对宿主的侵袭能力,因此推测环境诱变后的奇异变形杆菌的耐药性也可能发生变化,但仍需要相关后续实验证实。

[1] Kim DJ,Boylan B,George N,et al.Inactivation of ompR promotes precocious swarming and flhDC expression in Xenorhabdus nematophila[J].J Bacteriol,2003,185(17):5290-5294.

[2] 贾雄飞,刘俊康,徐启旺.奇异变形杆菌周期性群集运动的研究[J].第三军医大学学报,2005,27(9):868-870.

[3] 叶应妩,王毓三,申子瑜.全国临床检验操作规程(第3版)[M].南京:东南大学出版社,2006:727.

[4] Berg HC.Swarming motility:it better be wet[J].Curr Biol,2005,15(15):R599-600.