10种常见细菌基因检测膜条的研制

朱飞舟,陈利玉,刘新发,田 奇,谈 成,欧阳方丹,吴正理＊,陈汉春＊

(1.中南大学生物科学与技术学院生物化学系,湖南长沙 410013;2.中南大学基础医学院医学微生物学系,湖南长沙 410013;3.中南大学生物科学与技术学院生物实验中心,湖南长沙 410013)

病原菌引起的感染性、传染性疾病是威胁人类健康和导致社会恐慌的重要因素,快速准确地检测病原菌是有效预防和治疗这类疾病的关键。常规的生理生化、血清学鉴定方法操作繁琐、周期长,而且某些病原菌培养困难。PCR、EL ISA等方法虽然缩短了检测周期,但假阳性率高[1-2]。基因芯片(gene chip)技术的兴起,使快速、微量、准确、高通量地检测病原菌成为可能[3]。基因芯片检测病原菌选取的靶基因一般为16S rRNA和23S rRNA基因及16S～23S rRNA基因间隔区等[4],标记基因的方法有Cy3或Cy5等荧光染料、生物素、地高辛等[4-5]。目前应用的病原菌检测芯片多采用荧光标记,操作中需要激光共聚焦微阵列扫描仪、基因芯片点样仪等贵重仪器[6]。本研究选取细菌16S rRNA基因为检测靶点并设计探针,硝酸纤维素薄膜条作为固定探针的基质,利用生物素标记16S rRNA基因PCR扩增片段,然后杂交和检测,建立了一种高通量、低成本、快速、准确的细菌检测方法。该方法具有良好的临床应用前景,对感染性、传染性疾病的预防、诊断、治疗具有重要的价值。

1 材料与方法

1.1 材料

10种细菌:大肠埃希菌,肠道沙门菌,粘质沙雷菌,阴沟肠杆菌,奇异变形杆菌,铜绿假单胞菌,鲍曼不动杆菌,枯草芽胞杆菌,溶血性葡萄球菌,金黄色葡萄球菌由中南大学基础医学院医学微生物学系保存。

1.2 方法

1.2.1 细菌基因组DNA提取 ①CTAB法提取细菌基因组DNA:接种菌株于LB液体培养基,37℃震荡培养过夜,取1.5 mL培养物于12 000 r/min离心2 min。去上清液,加入567μL的TE缓冲液,震荡重新悬浮细菌。然后,加入30μL 10%SDS和15μL 20 mg/mL蛋白酶K(革兰阳性菌需先加入20μL 10 mg/mL溶菌酶,37℃反应15 min后再加入蛋白酶K),混匀,于37℃温育1 h,其间多次颠倒混匀。溶液变澄清则表示细菌裂解完全。随后,加入100μL 5 mol/L NaCl和80μL CTAB(Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide,十六烷基三甲基溴化铵)/NaCl溶液(5 g CTAB溶于100 mL 0.5 mol/L NaCl溶液中,加热至65℃使之溶解后室温保存),混匀,65℃温育10 min,可见白色沉淀。然后加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25◇24◇1),混匀至乳浊状。12 000 r/min离心5 min,转上清液至一洁净试管,加入与上清液等体积的异丙醇,轻轻混匀,直至产生絮状DNA沉淀。12 000 r/min离心5 min,去上清液,沉淀用1 mL的70%乙醇洗涤。离心,弃乙醇,在洁净工作台中干燥沉淀。最后,将沉淀溶于50μL TE缓冲液,加入1μL RNase A(10 mg/mL),4℃保存备用;②丙酮直接煮沸法:取细菌悬液,加入等体积丙酮,置于沸水浴中煮沸10 min。然后12 000 r/min离心2 min,其上清液即为细菌DNA溶液,可以作为PCR扩增的模板。

1.2.2 PCR扩增16S rRNA基因片段 引物合成和生物素标记由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。建立50μL PCR反应体系:DNA模板1μL,ddH2O 38.5μL,10×PCR缓冲液5μL,25 mmol/L MgCl22μL,10 mmol/L dNTP 1μL,20 μmol/L引物(1)1μL,20μmol/L引物(2)1μL,5 U/μLTaqDNA聚合酶0.5μL。采用PTC-100 Peltier Ther malCycler(B IO-RAD)进行PCR反应,反应程序为94℃变性5 min后于94℃变性45 s、55℃退火45 s、72℃延伸90 s,30个循环后于72℃延伸7 min。4℃保存备用。

1.2.3 PCR产物序列分析 引物27F和1492R对细菌16S rRNA基因的PCR产物正反测序,由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成。

1.2.4 序列同源性比对 根据测序所得的10种细菌16S rRNA基因片段的序列图,去掉两端的不规则峰,取中间1 380 bp片段序列进行同源性分析。如果要鉴定细菌,则将序列导入美国NCB I网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的blastn在线软件,选择Nucleotide collection(nr/nt)数据库,然后运行blastn程序,取16S rRNA基因序列同源性最高的细菌作为鉴定的结果。如果要比对10种病原细菌16S rRNA基因序列的同源性,则将它们的序列导入ClustalX(1.86)软件,然后在菜单中选择Alignment→Do Complete Alignment,即得10种细菌的16S rRNA基因序列同源性比对图。

1.2.5 基因检测膜条的制备 根据10种病原细菌16S rRNA基因序列比对的结果,在引物对250F/Bio-1020R扩增的770 bp片段内,寻找序列多态性位点,并以该位点的正向序列设计探针,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将探针按图5的布局点在硝酸纤维素膜上,80℃烤膜1～2 h,使探针与膜牢固结合,即得10种病原细菌的基因检测膜条。

1.2.6 核酸分子杂交 以细菌DNA为模板,用引物对250F/Bio-1020R进行PCR扩增,得到生物素标记的16S rRNA基因770 bp片段。将该PCR产物100℃水浴变性5 min,冰浴骤冷。基因检测膜条经预杂交后,向杂交液中加入变

性的生物素标记的PCR产物,杂交1 h,洗膜。然后,封闭30 min,SA-AP(streptavidin labled by alkaline phosphatase,碱性磷酸酶标记的链亲和素)(1◇1 000稀释)结合30 min,洗膜,NBT(nitroblue tetrazolium,硝基四氮唑蓝)/BCIP(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate,5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸)显色。肉眼观察,Gel DocTMXR+ Imaging System(B IO-RAD)照相。

2 结果与分析

2.1 16S rRNA基因序列分析法鉴定细菌

为确定这10种细菌,在制备基因检测膜条之前采用16S rRNA基因序列分析法对这10种细菌进行鉴定。采用CTAB法或丙酮直接煮沸法提取细菌基因组DNA。结果表明,CTAB法和丙酮直接煮沸法提取的DNA均可作为PCR扩增的模板,但丙酮直接煮沸法快速、简单,更适于临床应用。27F和1492R引物的通用性好,可以扩增10种细菌的16S rRNA基因片段,扩增片段大小为1 450 bp左右(图1)。以扩增片段为模板,引物27F和1492R正反测序,然后根据序列的同源性对细菌进行鉴定,同源性最高的细菌即为鉴定的结果。以金黄色葡萄球菌鉴定为例进行说明。取测序所得的金黄色葡萄球菌16S rRNA基因1 380 bp片段的序列,在线软件blastn中比对后,选择Taxonomy reports,即可得到具有同源序列的细菌,以同源性从高到低的顺序从上往下排列,序列同源性最高的细菌就是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(图2)。10种细菌鉴定的结果见表1。

2.2 设计10种细菌的通用引物和探针

为设计通用引物和探针,将10种细菌16S rRNA基因片段序列进行比对,寻找16S rRNA基因中的序列保守区和多态区(图3)。利用保守区设计通用引物250F和bio-1020R(表2),利用多态区设计探针。

2.3 膜条检测10种细菌

将10种细菌的16S rRNA基因片段进行体外扩增,并在扩增的同时将扩增片段进行生物素标记。以细菌的基因组DNA为模板,通用引物250F、bio-1020R可以扩增10种细菌的16S rRNA基因片段,长度在770 bp左右(图4A)。随后,检测反向引物bio-1020R生物素标记是否成功,结果发现1020R(没有生物素标记、但序列与bio-1020R完全相同的引物)经检测没有信号,而bio-1020R经检测有很强的信号,说明生物素已经成功标记在bio-1020R引物的5′端(图4B)。这也说明扩增得到的16S rRNA基因片段已经被生物素标记,可以用于后续的核酸分子杂交实验。

图2 金黄色葡萄球菌16S rRNA基因片段序列在Nucleotide数据库中比对的结果Fig.2 Aligning 16S rRNA gene fragment sequence ofStaphylococcusaureus in Nucleotide database

图3 10种细菌16S rRNA基因序列比对Fig.3 Alignment of 16S rRNA gene fragment sequences of 10 species of bacteria

图4 用于核酸分子杂交的16S rRNA基因片段扩增Fig.4 Amplifying 16S rRNA gene fragments used in DNA hybridization

表1 16S rRNA基因序列分析法鉴定细菌的结果Table 1 Identification of bacteria by 16S rRNA gene sequence analysis

表2 16S rRNA基因片段扩增引物Table 2 Primer sequences for amplifying 16S rRNA gene fragments

用扩增的10种细菌的16S rRNA基因片段分别与膜条进行杂交,检测膜条的特异性和有效性。用膜条分别与10种细菌16S rRNA基因扩增片段杂交,结果发现出现相对应的、特异性的信号,而无序的核酸探针均没有信号,细菌通用探针均出现信号(图6A～J)。这说明该膜条能特异地、有效地检测这10种细菌。同时扩增大肠埃希菌、肠道沙门菌、粘质沙雷菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌5种细菌的16S rRNA基因片段,并与膜条杂交,结果发现5种菌的探针均出现信号,说明该膜条可以同时检测出这5种细菌(图6K)。

图5 10种细菌检测膜条的探针排列顺序Fig.5 Array of probes for 10 species of bacteria in the membranous oligonucleotide chip

图6 膜条检测10种细菌Fig.6 Detection of 10 species of bacteria by the membranous oligonucleotide chip

3 讨 论

目前,病原菌的常规检测主要采用细菌培养、生化鉴定和血清学抗原抗体检测等传统方法。这些方法操作繁琐、周期长、通常报告结果需要3～5 d,而且某些病原菌培养困难。近年来也发展了PCR、EL ISA等技术,但无法满足一次检测多样本和多种病原体的需求,且假阳性率较高[1-2]。基因芯片是指将许多特定的DNA片段作为探针有序地紧密排列并固定在固相支持物上,然后与待测的标记样品进行杂交,杂交后进行检测和比较分析。该技术自20世纪末出现以来,已经被广泛地应用于生命科学的众多领域,如基因表达分析、基因突变检测、基因诊断、新基因发现等。在病原菌检测方面,基因芯片以快速、微量、准确、高通量的特点,迅速得到广泛应用[7-9]。

与传统病原菌检测方法相比,本研究建立的膜条杂交法的优势在于:1、高度灵敏性。可以直接检测临床样本中的病原菌,无需培养。第一步是PCR,可以直接以临床样本中病原菌的微量DNA为模板,扩增16S rRNA基因片段;2、高准确性。膜条能特异有效地检测10种细菌中的任何一种,准确性高,不存在交叉反应。3、高通量。1张膜条可以同时检测多种病原菌,且DNA提取、PCR、杂交、检测均可多个样本同时进行。4、快速。全部流程在1个工作日内即可完成。

在基因芯片技术中,标记基因的方法有Cy3或Cy5等荧光染料、生物素、地高辛等[4-5,10],基质有玻片、硝酸纤维素薄膜、尼龙膜等[11-12]。最近,在病原菌的基因芯片检测技术中涌现出一些新方法,如96微孔板DNA诊断芯片[13]、Lab-on-achip[14]。96微孔板DNA诊断芯片,即将多个病原菌的检测探针点在96孔板的1个孔中。Labon-a-chip就是将样品制备、PCR、杂交等操作流程集中在1块板上,1次即可完成所有的程序。

本研究选用硝酸纤维素薄膜条作为固定探针的基质,采用生物素标记细菌16S rRNA基因的扩增片段,SA-AP检测生物素标记,然后NBT/BCIP显色,建立了一种快速、准确、低成本的细菌检测方法。与其他基因芯片方法相比,本方法具有成本低、无需特殊设备、结果直观等优点。

本研究选用10种常见细菌为研究材料,目的是建立用膜条检测样本中病原菌的方法。在此基础上可开发感染性疾病和/或病原菌及支原体、病毒等鉴别诊断膜条。本方法将为促进生物产业的发展作出积极的贡献。

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