红曲霉T-DNA插入突变库中色素突变子的筛选

庄静娜,蔡琪敏,曹丽凌,韦 凤,蒋冬花

(浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江金华 321004)

红曲霉属于腐生型真菌,是我国重要的传统微生物资源,目前认为红曲霉属于真菌门(Eumycota)、子囊菌亚门(Ascomycotina)、不整子囊菌纲(Plectomyhcetes)、散囊菌目(Eurtotiales)、红曲科(Monascaceae)[1]。红曲霉是我国最早应用于食品加工的有益真菌之一,以其能产生大量天然红色素而著称,主要应用在制醋、着色、防腐等领域,在国外主要应用于肉品加工及其他食品的着色上以及进行关于淀粉酶、糖化酶的研究与探讨[2]。但自从Blanc等[3]发现红曲中含有真菌毒素—桔霉素以来,红曲的安全性受到广泛关注。如何提高红曲中有益代谢产物的含量,同时控制桔霉素含量是当前研究的热点之一。目前主要是通过菌种选育及发酵工艺条件优化等来达到调控目的[4],也有试图通过掌握红曲菌代谢的分子调控机理,从分子水平上调节代谢产物分泌的研究报道[5-6]。尽管已经得到了一些产桔霉素及Monacolin K相关的基因,但是由于真菌代谢过程较为复杂,要确切阐明参与不同代谢途径基因的功能及其相互关系还需要大量的基因组信息,所以有必要开展相关研究,建立有效的遗传转化系统,筛选相关突变株,研究相关基因的功能。本实验以根癌农杆菌介导的红曲霉突变库中754株突变子菌株为材料,通过乙醇提取法筛选出产色素发生显著变化的色素突变子,并对其菌落形态、显微结构、遗传稳定性以及桔霉素含量等进行了分析,以期阐明红曲色素代谢的分子机制,为研究红曲霉产色素相关基因奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 原始菌株:紫色红曲霉(M onascus purpureus)菌株S,由本实验室筛选并保藏,具有高产色素能力;突变菌株:754株突变子菌株来自于本实验室构建的红曲霉T-DNA插入突变库,并由本实验室保藏。

1.1.2 主要培养基 PDA培养基:马铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂20 g,蒸馏水加至1 L,121℃灭菌20 min;色素振荡培养基:葡萄糖70 g,蛋白胨30 g,KH2PO48 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,KCl 0.5 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,蒸馏水加至1 L,121℃灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 筛选突变子 将红曲霉T-DNA突变库中保存的突变子活化后,转接到PDA培养基中,30℃培养7～14 d,与原始菌株S比较,根据菌落形态、大小、颜色和生长速度等特征,挑选变异明显的突变子,拍照,保存备用。

1.2.2 PCR鉴定潮霉素抗性 采用CTAB法提取红曲霉基因组DNA[7]。根据pAT MT1上的潮霉素基因序列设计引物HygS1和HygA1,序列分别为5-ATGCCTGAACTCACCGCGAC-3,5-CTATTCCTTTGCCCTCGGAC-3,进行PCR扩增。PCR扩增体系为10×PCR buffer 5μL,MgCl2(25 mmol/L)3μL,dNTP(10 mmol/L)1μL,Taqpolymerase 1μL,HygS1(10μmol/L)1μL,HygA1(10μmol/L)1μL,DNA Template 1μL,ddH2O 37 μL。PCR反应程序为94℃,3 min后进入循环,每个循环条件:94℃,20 s;58℃,60 s;72℃,2 min共35个循环,然后72℃延伸10 min。扩增结束后电泳,拍照记录。

1.2.3 分析遗传稳定性 将随机挑选的突变子用无菌牙签挑取菌丝接种到不含潮霉素的PDA培养基上,30℃培养7 d。连续转接6次后,再转接到含100 mg/mL潮霉素的PDA培养基上,同时接种原始菌株S作为对照,30℃培养,观察突变子的生长情况和菌落形态,并计算其稳定性。

1.2.4 测定红曲色素含量 将突变子菌株接种于PDA培养基上活化,按2%的接种量接入装有40 mL振荡培养基的250 mL锥形瓶中,30℃、200 r/min振荡培养7 d。取培养液加95%乙醇,4℃,8 000 r/min离心15 min,取上清,稀释,以相同处理(加95%乙醇)的不接红曲霉的培养液作为空白对照,测定300～600 nm波长下的OD值,分析吸收峰值。色价(U/mL)=稀释倍数×吸光值。

1.2.5 测定桔霉素含量 取红曲霉菌丝,加入10 mL甲醇,制成样品。将样品点样于制好的硅胶板上,用展开剂(甲苯◇乙酸乙酯◇甲酸=6◇3◇1,体积比)展开,在紫外灯下将对应位置的黄绿色硅胶刮下,甲醇浸泡静置,过滤3次,60℃水浴蒸发至干,加甲醇沉淀至3 mL,紫外分光光度计在254 nm波长下测定吸光度,对照标准曲线换算桔霉素含量。

2 结果与分析

2.1 突变子的菌落及显微形态

2.1.1 菌落形态 将754株突变子接种到PDA培养基上,30℃培养7 d,比较突变子菌株与原始菌株在菌落形态、颜色等方面的差异。结果表明,大部分突变子菌株与原始菌株差别不大,只有少数突变子菌株发生较大变化,见图1。原始菌株(右图左上菌落)菌落隆起,呈橙黄色,气生菌丝致密,生长速度较快,而部分突变子菌株颜色变浅,有的甚至变为白色;部分突变子菌株颜色加深,变为橙红色;部分突变子菌株菌落平坦,气生菌丝不明显;部分突变子菌株菌落性状极不规则;部分突变子菌株生长速度比原始菌株快得多。

2.1.2 显微形态 将随机挑选的突变子菌株与原始菌株S在PDA培养基上培养7 d,挑取菌丝制成玻片,在显微镜下观察形态特征。如图2所示,原始菌株S(最左图)的菌丝呈透明胶管状,隔膜清晰,分生孢子与子囊孢子均较多,囊内孢子可见,而部分突变子菌株的菌丝透明且细小,隔膜不明显,闭囊壳数目少,孢子也少;部分突变子菌株的菌丝中色素颗粒较多,呈现红色,不透明;部分突变子菌株的菌丝形状不规则,旁枝很多。

图1 部分转化子菌株的菌落形态图Fig.1 Colonymorphology of partial transfor mant strains ofMonascus purpureus

图2 部分转化子菌株的显微形态(400×)Fig.2 Micro-morphology of partial transformant strains ofM onascus purpureus(400×)

2.2 PCR鉴定潮霉素抗性

图3 转化子总基因组中hph基因的PCR扩增结果Fig.3 PCR analysis of hphgene in hygromycin B-resistant trans formants of S

若根癌农杆菌Ti质粒中的T-DNA成功转移到红曲霉基因组DNA中,就可以扩增出1 106 bp的潮霉素基因特征条带,据此可以鉴定T-DNA是否成功插入到红曲霉基因组中。由图3可见,随机挑取的9株突变子在1 000 bp左右均有条带,且条带清晰,无杂带,与预期潮霉素基因片段长度吻合,而原始菌株S没有扩增出相应的条带,这表明T-DNA已经插入到红曲霉基因组DNA中。

2.3 遗传稳定性

作为研究基因功能的材料,要求其在遗传上具有稳定性。本实验将754株突变子接种到PDA培养基上,随机挑选50株突变子菌株进行稳定性研究。结果显示,48株均能在含有100 mg/mL潮霉素的PDA培养基上正常生长,而原始菌株与剩余的2株突变子菌株不能正常生长。色素突变子的遗传稳定性达94.12%,表明潮霉素抗性基因已经整合到红曲霉基因组中,并能稳定遗传。

2.4 红曲色素含量

将红曲霉原始菌株与随机挑选的9株突变子菌株的乙醇浸提液适当稀释后,于505 nm测定吸光度,并计算色价,结果见图4。由图4可知,上述突变子的色价与原始菌株S相比,除了突变株S67的色价无明显差异外,其他均发生了显著变化,S66、S71、S73这3株突变子菌株的色价明显升高,其中S71高达117.47 U/mL,是原始菌株S色价66.37 U/mL的1.77倍;S26、S50、S67、S68、S69、S72这6株突变子菌株的色价明显降低,其中S50菌株的色价最低,仅为7.65 U/mL,只有原始菌株S色价66.37 U/mL的0.12倍。

图4 原始菌株S和色素突变子的红曲色价(P<0.01)Fig.4 Pigment-values of fermentation produced by original

将红曲霉原始菌株与随机挑选的9株突变子菌株的乙醇浸提液适当稀释后,于300～600 nm进行UV-V IS扫描,扫描图谱见图5(其中各图的横坐标均为波长,纵坐标均为OD值)。研究各突变子菌株的UV-V IS扫描图谱特征发现,红曲霉突变子不仅在505 nm处的色价发生了变化,而且吸收波长也发生了不同程度的变化,如S26和S50均只有390～400 nm左右的1个吸收峰,而原始菌株S有2个吸收峰。此现象的原因可能是突变子的色素代谢途径发生了某些变化,使色素的组成发生了改变,这对色素相关基因的研究有重要意义。

2.5 桔霉素含量

采用薄层层析法测定原始菌株与上述突变子菌株发酵液中的桔霉素,根据标准曲线方程计算含量,结果显示,9株色素突变子发酵液中桔霉素的含量与原始菌株相比发生了不同程度的变化。S69的桔霉素含量与原始菌株S相似,而S26、S66、S67、S73这4株突变子菌株的桔霉素含量明显升高,其中S73高达2.06μg/g,是原始菌株S含量0.53μg/g的3.87倍;S50、S68、S71、S72这4株突变子菌株的桔霉素含量明显降低,其中S50菌株的含量最低,仅为0.13μg/g,只有原始菌株S含量0.53μg/g的0.24倍(图6)。

图5 色素突变子红曲色素95%乙醇浸提物紫外-可见扫描图Fig.5 UV-V IS spectrum ofmonascus pigment extracted from original strain S and color-producing transformants by 95%of ethanol

图6 原始菌株S和色素突变子的桔霉素含量Fig.6 Citrinin content of original strain S and color-producing transfor mants

3 讨 论

根据基因的变化研究表型的变化,从而验证基因的功能,这是研究基因功能的常用方法,即所谓的反向遗传学分析技术。该技术为研究微生物的生命活动提供了契机[8]。农杆菌介导的TDNA转化法是一种常用的研究基因功能的反向遗传学策略,T-DNA标签的导入可以破坏基因,影响相关表型的改变。以感兴趣的突变体为材料,根据标记序列选取恰当的方法可以克隆到相关基因。本实验是以T-DNA插入到红曲霉基因组,插入到红曲霉基因组后会影响某些基因的表达,从而引起突变,这些变化将会表现在各个方面,形态突变是比较直观的方面,而菌落形态等的直观变化又常常和其他重要改变,如次级代谢产物相关联。本实验研究发现,与出发菌株相比,突变子菌落形态发生的变异主要表现在以下几个方面:菌落大小、菌落颜色、气生菌丝形态、菌体产孢子能力、菌落发生隆起突变、出现辐射纹或裂纹等。这可能与Leung等[9]和Negritto等[10]提到的扇形突变现象有关。

微生物的次级代谢是指在一定生长时期(通常在后期),以初级代谢物质为前体物质,合成的一类对微生物的生命活动无明确功能物质的过程。次级代谢产物的合成与相关酶所催化的代谢途径有关,它们多数是菌株所特有的性质。尽管有些学者对红曲霉部分代谢产物做了一些研究,但是红曲霉各种主要次级代谢过程以及代谢途径尚不清楚。本实验对9株色素突变子产色素以及桔霉素的能力进行了分析测定,测定结果表明,色素突变子分泌桔霉素的能力发生了不同程度的变化,推测可能与T-DNA插入位点不同有关。突变子的次级代谢产物有此消彼长的趋势,例如,突变子S26分泌桔霉素的能力提高,但色素分泌减少;而突变子S50分泌桔霉素和色素的能力均降低。这一方面可能与T-DNA插入位点多样性阻断了与不同的代谢产物相关的基因位点有关,另一方面也可能是红曲霉的代谢产物由于存在部分共同的代谢途径,阻断了其中的一个位点从而影响到其它代谢产物的生成。有报道认为洛伐他汀、红曲色素、桔霉素三者都是聚酮体合成酶(PKSs)催化合成的产物[11]。若能找到控制桔霉素合成途径中编码酶的基因,并实施定点敲除或破坏,有可能阻断桔霉素的生成而不影响甚至促进红曲色素的产生。这有待于进一步的研究。

[1] 王汝毅.根癌农杆菌介导红曲霉转化库的构建及转化子性质研究[D].武汉:华中农业大学,2005.

[2] 方元超,杨柳.红曲霉研究进展综述[J].四川食品与发酵,1999,1:19-24.

[3] 李云,阎雪秋,李枚秋,等.红曲与桔红霉[J].食品与发酵工业,1999,26(3):82-87.

[4] 孟昭爀,张国柱,宋圃菊.真菌毒素研究进展[M].北京:人民出版社,2003.

[5] 傅金泉.中国红曲及其实用技术[J].北京:中国轻工业出版社,1997:1-3.

[6] 周礼红,王正祥,诸葛健.红曲霉不同转化方法的比较[J].遗传,2006,28(4):479-485.

[7] Stevens R.Mycology Guidebook[M].Seatle:University of Washington Press,1974.

[8] 蒋玲艳,王林果.反向遗传学技术及其应用[J].医学综述,2006,12(6):323-325.

[9] R.Leung,J Q.Koenig,N.Simcox,et al.Behavioral changes following participation in a home health promotional program in King County,Washington[J].Environ Health Persp,1997,105(10):1132-1135.

[10] MTNegritto,XWu,T Kuo,et al.Influence ofDNA sequence identity on efficiency of targeted gene replacement[J].MolCell Biol,1997,17(1):278-286.

[11] 鲁佳慧,刘昕,王江海,等.红曲的生产工艺及Monacolin K和桔霉素的检测[J].现代食品科技,2006,22(1):144-146.