家蚕细小病毒样病毒(BmPLV-Z)VD1 ORF4的原核表达

李国辉，唐琦，张俊红，郭旭丽，胡朝阳，姚勤

(江苏大学生命科学研究院，江苏镇江212013)

家蚕细小病毒样病毒(Bombyx mori parvo-like virus，BmPLV)是一类无囊膜包被的、单链、双分子DNA病毒，具有20面体结构，大小约19～24 nm，能特异性感染家蚕中肠柱状上皮细胞，导致家蚕罹患软腐病［1-2］。本研究小组于2005年完成了镇江株基因组的克隆和测序，其序列分析表明该病毒基因组为线性、单链双分子DNA，其中VD1由6 543个核苷酸组成，理论上含有4个开放读码框;VD2由6 022个核苷酸组成，理论上含有2个开放读码框［3］。VD1序列分析进一步表明其基因组内含有一个大的开放读码框(命名为ORF4)，由3 318个核苷酸组成，理论上编码1个含有1 115个氨基酸组成的蛋白，同源搜索发现该蛋白质与以蛋白为引物的DNA聚合酶B家族同源，该蛋白氨基酸一级序列706～1 004位点处存在5个保守的区域:Dx2SLYP(motifⅠ)，Kx3NSxYG(motifⅡ)，Tx2G_AR(motifⅢ)，Yx-DTDS(motifⅣ)和KxY(motifⅤ)，这些区域与DNA聚合酶的功能有关，例如:DNA合成，dNTP结合，以及磷酸化水解等［4-5］。由此推测VD1 ORF4编码的蛋白具有DNA聚合酶活性，可能负责病毒自身DNA的复制。鉴于该蛋白在感染组织中的真实分子量大小、在病毒复制、侵染过程中的具体作用未知以及鉴定其与宿主相互作用蛋白因子等方面的考虑，为此，获得该蛋白的高效价抗体是一种常用且有效的研究手段。本研究扩增家蚕细小病毒样病毒VD1 ORF4编码DNA聚合酶的同源区，并将构建的表达载体转化原核细胞中进行诱导表达，以表达的产物免疫昆明小鼠制备该蛋白的抗体。对VD1 ORF4理论上的编码框序列进行生物学信息分析，在不发生移码的基础上发现其有18个可以采用的起始密码子ATG，而选择不同的ATG作为翻译起始位点可以产生分子量大小不同的蛋白质，浓核病毒中很多蛋白正是通过核糖体对同一信使mRNA漏扫描翻译而来的。为了研究VD1 ORF4读码框在原核表达系统中是否也有漏扫描现象，分别对VD1 ORF4编码区全长(3 318 bp)以及具有相同的3'-末端而5'-端不同(2 163 bp)的2个DNA片断进行克隆，对构建的表达载体在原核表达细胞中进行诱导表达，通过制备的多抗对原核表达产物进行Western blot分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒、菌种携带家蚕细小病毒样病毒VD1 ORF4全长的克隆质粒pMD18T-3 318 bp由本室保存;原核表达载体pET-30a质粒、克隆菌株大肠埃希菌(Escherichia coli)DH5α和表达菌株E.coli RosettaTM2(DE3)plysS均购自Novagen公司。雄性昆明小鼠购自江苏大学动物实验中心。

1.1.2 主要试剂限制性内切酶EcoRI、XhoI、BamHI、Taq酶、LA Taq酶、250 bp DNA Ladder Marker、蛋白质Marker(低分子量和高分子量)均购自TaKaRa公司;质粒提取和胶回收试剂盒购自Omega公司;蛋白质预染MarkerIII购自Fermentas公司;抗体纯化试剂盒购自美国Millipore公司;氯霉素和IPTG购自上海生物工程有限公司，丙烯酰胺和N，N-亚甲基双丙烯酰胺购自Promega公司;Anti-His单抗购自Invitrogen公司;HRP标记的羊抗鼠二抗、DAB显色试剂盒购自武汉博士德公司;弗氏完全佐剂和不完全佐剂购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计参照BmPLV-Z基因组VD1 ORF4序列［3］，通过Primer Premier 5软件设计5条引物:上游引物F1:5'-CCG GAATTCAAATGCCTTTAGTGAAGATTAC-3'和下游引物R1:5'-CCG CTCGAG TTATTCAATTACAACATCATC-3'扩增VD1 ORF4全长3 318 bp;上游引物F2:5'-CCG GAATTC ATGTTTTTAACTGATTTATATAGTA-3'和下游引物R1:5'-CCG CTCGAG TTATTCAATTACAACATCATC-3'扩增VD1 ORF4 2 163 bp，扩增的这2个目的DNA片断具有相同的3'-末端而5'-端不同，它们两端分别引入了EcoRI和XhoI酶切位点;同时，设计了2条引物用来扩增VD1 ORF4 DNA聚合酶同源编码区，这2条引物分别为:上游引物F3:5'-AT GGATCCGTTTATCTTGATGTAT-3'和下游引物R2:5'-AA CTCGAGTTATAAGGCATTCTTA，引物两端分别引入了BamHI和XhoI 2个酶切位点。

1.2.2 PCR扩增和重组子的构建以pMD18T-3 318 bp为模板、以F1/R1、F2/R1为引物对，通过LA Taq酶分别进行扩增，反应条件:94℃预变性5 min，94℃变性40 s、52℃退火40 s、72℃延伸3 min，35个循环，最后72℃延伸10 min，以EcoRI和XhoI对纯化的PCR产物进行双酶切，将回收后的目的片断与经同样双酶切的表达载体pET30a进行连接，将连接产物转化DH5α感受态细胞，对平板上的克隆进行鉴定，目的重组质粒命名为pET30a-3 318 bp和pET30a-2 163 bp;同样，以pMD18T-3 318 bp为模板、以F3/R2为引物对，通过Taq酶进行扩增DNA聚合酶同源区，反应条件:94℃预变性5 min，94℃变性40 s、53℃退火40 s、72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min，以BamHI和XhoI对纯化的PCR产物进行双酶切，将回收后的目的片断与经同样双酶切的表达载体pET30a进行连接，将连接产物转化DH5α感受态细胞，对平板上的克隆进行鉴定，目的重组质粒命名为pET30a-1 077 bp。

1.2.3 融合蛋白的诱导表达、鉴定和多克隆抗体的制备将重组质粒pET28a-1 077 bp转化E.coli RosettaTM2(DE3)plysS感受态细胞。挑取鉴定正确的阳性克隆接种3 mL LB培养基，37℃摇床培养过夜，次日按1∶100转接，至OD600为0.5，通过加入不同浓度的IPTG(0、0.2、0.5、0.8、1.0 mmol/L)对其进行诱导，37℃诱导6 h，对收集菌体中的目的蛋白进行12%的SDS-PAGE检测，通过抗6×His标签的单抗对目的蛋白N-端融合的6×His Tag进行免疫印迹分析，进而确定诱导的蛋白带为目的蛋白。采用割胶回收的方法对融合蛋白进行纯化:直接从SDS-PAGE胶上割取所需要的目的带，用PBS洗涤过夜，将小胶块与适量的PBS混合，总体积不超过2 mL，研磨成匀浆。纯化的融合蛋白与等体积的弗氏佐剂乳化后对昆明小鼠皮下多点注射［6］。

1.2.4 重组子(pET30a-3 318 bp和pET30a-2 163 bp)的诱导表达和Western blot分析将构建的两种重组子转化宿主表达菌E.coli RosettaTM2(DE3)plysS，挑取鉴定正确的阳性克隆接种3mL LB培养基中，通过0.8 mmol/L IPTG对其进行诱导表达，超声破碎后，对上清与沉淀分别进行SDS-PAGE和Western blot分析，进而分析VD1 ORF4在原核表达系统中能否选择不同的ATG作为起始密码子来启动蛋白的翻译，同时对表达质粒pET30a-3 318 bp和pET30a-2 163 bp在原核宿主中目的蛋白的表达情况进行比较。

2 结果与分析

2.1 重组质粒pET30a-1 077 bp、pET30a-2 163 bp和pET30a-3 318 bp的构建

以pMD18T-3 318 bp为模板，以F3/R2、F2/R1和F1/R1分别为引物对进行PCR扩增，分别扩增到一条大小为1 077、2 163和3 318 bp的特异片段，将双酶切后的PCR产物连接到同样双酶切后回收的pET30a载体上，对获得的重组质粒分别命名为pET30a-1 077 bp、pET30a-2 163 bp和pET30a-3 318 bp。对构建的目的质粒分别进行PCR扩增、BamHI/XhoI以及EcoRI/XhoI双酶切鉴定，电泳结果与理论预计一致，3个片断的测序结果与NCBI网上公布的序列完全一致，表明已成功扩增到VD1 ORF4 3个不同区域的DNA片断，3个扩增片断都已成功连接到原核表达载体pET30a上。

图1 重组表达质粒的酶切鉴定Fig.1 Restriction analysis of the constructed recombinant plasmid

2.2 VD1 ORF4 DNA聚合酶同源编码区序列(1 077 bp)在E.coli中的诱导表达

将构建的重组质粒pET30a-1 077 bp转入宿主表达菌株E.coli RosettaTM2(DE3)plysS后，通过不同浓度的IPTG对其进行诱导，5 h后收菌并对处理的菌体进行SDS-PAGE电泳，结果表明:在44 ku处出现了1条特异的诱导蛋白带，比预期大小略大(图2A3～6);而空白对照在相应的位置上没有出现诱导的蛋白带(图2A1)。通过Anti-His单抗对诱导蛋白带进行Western blot检测，结果发现仅在目的蛋白处有一明显的杂交信号条带(图2B2)，表明诱导的目的蛋白成功地进行了融合表达。

图2 靶蛋白在大肠埃希菌E.coli RosettaTM2(DE3)plysS中的表达和Western blot分析Fig.2 Identification and confirmation of target protein expressed in E.coli RosettaTM2(DE3)plysS by analysis of SDS-PAGE and Western blot

2.3 抗体的纯化

将原核表达的重组蛋白经割胶纯化后，用作抗原免疫昆明小鼠。2个月后，摘取小鼠眼球进行采血获得抗血清。对经Millipore公司抗体纯化试剂盒(PROSEP-A Media)纯化后的抗体进行SDS-PAGE凝胶电泳。结果表明:在22 ku和50 ku处各出现一条带(图3)，说明抗体纯化的效果较好，可用于下一步研究之中。

图3 多克隆抗体的纯化Fig.3 Purification of polyclonal antibody using Millipore kit

2.4 VD1 ORF4全长(3 318 bp)和部分长度(2 163 bp和1 077 bp)在E.coli中的表达

将构建含有VD1 ORF4全长和部分长度的DNA重组质粒:pET30a-3 318 bp、pET30a-2 163 bp和pET30a-1 077 bp分别转入宿主表达菌株E.coli RosettaTM2(DE3)plysS后，通过0.8 mmol/L的IPTG对其进行诱导，5 h后收集菌体并对其进行超声破碎，对超声破碎后的沉淀和可溶性上清分别进行SDS-PAGE凝胶电泳，结果表明:含有pET30a-3 318 bp重组质粒的宿主菌在120 ku处出现了1条特异诱导带(图4A2);含有pET30a-2 163 bp重组质粒的宿主菌在88 ku处出现了1条特异诱导带(图4A3);含有pET30a-1 077 bp重组质粒的宿主菌在44 ku处出现了1条特异诱导带(图4A4);而它们的对应上清中在理论位置上都没有出现很明显的特异诱导带，说明它们的诱导表达产物主要是以包涵体的形式存在。

为了进一步分析VD1 ORF4序列中的不同ATG作为起始密码子的可能性(不发生移码突变)，理论上除了一条主要目的带之外，泳道中还应有其他漏扫描表达蛋白带，鉴于这种考虑，通过制备的多抗对上述诱导的蛋白产物进行Western blot分析，结果发现3个泳道中都只出现了1条特异的杂交带，这些带的位置与它们在SDSPAGE中出现的特异带位置相一致，该结果表明VD1 ORF4在原核表达系统中的产物均一，在蛋白质合成过程中没有发生漏扫描现象。

图4 靶蛋白在大肠埃希菌E.coli RosettaTM2(DE3)plysS中的表达和Western blot分析Fig.4 Identification and confirmation of target protein expressed in

3 讨论

将BmPLV-Z VD1 ORF4编码的理论序列在Swissprot蛋白数据库中进行Blast搜索，结果发现该蛋白与DNA聚合酶B家族同源，推测BmLV-Z VD1 ORF4编码的蛋白很可能是一个DNA聚合酶，并引导病毒自身DNA的复制，但该蛋白的真实分子量大小还未知，是否具有DNA聚合酶的功能以及和宿主哪些蛋白发生作用?为此，本文对BmPLV-Z VD1 DNA聚合酶同源编码区片断进行PCR扩增，将双酶切回收后的DNA片段与原核表达载体pET30a进行连接，对目的重组子进行序列测定，其结果与理论上的序列完全一致。对捕获有目的重组质粒的大肠埃希菌E.coli RosettaTM2(DE3)plysS进行IPTG诱导，SDS-PGAE结果表明目的片段在原核细胞中实现了融合表达，Anti-His单抗对诱导的蛋白带进行免疫印迹分析结果证实了其表达。

本实验室曾将构建的表达质粒转化E.coli BL21/DE3宿主表达菌，但是多次诱导条件的摸索，包括调整IPTG的诱导浓度、诱导时间以及诱导温度，始终未见明显的目的蛋白诱导表达条带。在对目的基因片段VD1-ORF4/2 163 bp进行稀有密码子的分析之后，发现该段基因序列中稀有密码子比例较高，接近6%。根据这一分析结果，改用了RosettaTM2(DE3)plysS宿主表达菌。RosettaTM2(DE3)pLysS是BL21的衍生菌，该菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒，补充了稀有密码子AUA、AGG、AGA、CUA、CCC和GGA的tRNAs，能明显增强带有大肠埃希菌稀有密码子的蛋白的表达。改换了宿主表达菌后，即可检测到目的蛋白的表达条带，即使这样，VD1 ORF4长短不同的3个DNA片段在RosettaTM2(DE3)plysS宿主表达菌中的表达量彼此之间也相差很大，其中VD1 ORF4全长3 318 bp的表达量最低，2 163 bp的表达量稍高，1 077 bp的表达量最高，说明稀有密码子在这3个DNA片段中的分布频率和分布位置不同，同时也说明宿主菌的选择对外源基因的表达也是非常重要的。

漏扫描现象指的是mRNA在翻译为蛋白质的过程中，核糖体忽略了上游的位于非最优的AUG起始位点，而以下游的AUG为起始位点合成蛋白质多肽链;除受AUG位点上下游序列的影响，RNA的结构和其他结合蛋白、调控因子等其他的因素对翻译起始也有着重要的影响［7-8］。大蜡螟浓核病毒(GmDNV)4个分子量大小不一的核衣壳蛋白，它们具有不同的N-端序列，但C-端氨基酸序列是相同的，研究表明这是通过起始同一条mRNA转录本中不同的AUG密码子而来的［9］;Mythimna loreyi densovirus(MlDNV)的4个核衣壳VP蛋白也是同一条mRNA通过漏扫描翻译而来的［10］;库蚊浓核病毒(CpDNV)的4个核衣壳蛋白也是核糖体在mRNA上通过漏扫描产生的［11］，漏扫描或许是细小病毒在长期进化过程中有利于病毒生存的一种蛋白质合成机制。本研究

通过制备的VD1 ORF4部分肽段的多克隆抗体对VD1 ORF4全长和部分DNA序列在原核中的表达情况进行初步分析，结果表明3个泳道中都只检测到1条特异的蛋白带(图4)，它们彼此之间的表达量有明显差异，这与它们mRNA各自的序列特征密切相关;而未检测到漏扫描合成的蛋白，这或许与多种因素相关:比如原核表达质粒pET30a中的AUG始终为最优的起始翻译位点、原核宿主细胞内外源基因的表达不能真实反应病毒基因在真核宿主细胞内的表达情况以及病毒VD1 ORF4基因在家蚕细胞内确实只表达为一个蛋白等，为此，这还有待于对VD1 ORF4编码的蛋白在感染细胞中的真实表达情况进行下一步研究，除此之外，本文所制备的VD1 ORF4部分肽段的多克隆抗体为该蛋白的定位、互作蛋白的鉴定以及探讨病毒与宿主之间的相互作用提供了研究基础。

［1］ 张俊红，李国辉，陈慧卿，等.细小病毒非结构蛋白NS1功能的研究进展［J］.安徽农业科学，2010，38(22):11730-11731.

［2］ Tattersall P，et al.(2005)in Virus Taxonomy:VIIIth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses，eds Fauquet CM，Mayo MA，Maniloff J，Desselberger U，Ball LA(Academic/Elsevier)，p 1162.

［3］ Wang Y J，Yao Q，Chen K P，et al.Characterization of the genome structure of Bombyx mori densovirus(China isolate)［J］.Virus Genes，2007，35(1):103-108.

［4］ Kapitonov V V，Jurka J.Self-synthesizing DNA transposons in eukaryotes［J］.PNAS，2006，103(12):4540-4545.

［5］ Yang B J，Zhang D，Cai D，et al.Biochemical characterization of Periplaneta fuliginosa densovirus non-structural protein NS1［J］.Biochem.Biophys.Res.Commun，2006，342:1188-1196.

［6］ Sambrook J，Russell D W.Molecular cloning:A Laboratory Manual［M］.3rd ed.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989.

［7］ Kozak M.Pushing the limits of the scanning mechanism for initiation of translation［J］.Gene，2002，299(1-2):1-34.

［8］ 张静，蔡军，李衍达.人类可变翻译事件的研究［J］.中国科学，2007，37(2):198-203.

［9］ Tijssen P，Li Y，El-Far M，et al.Organization and expression strategy of the ambisense genome of densonucleosis virus of Galleria mellonella［J］.J Virol，2003，77(19):10357-10365.

［10］ Fédière G，El-Far M，Li Y，et al.Expression strategy of densonucleosis virus from Mythimna loreyi［J］.Virology，2004，320(1):181-189.

［11］ Baquerizo-Audiot E，Abd-Alla A，Jousset FX，et al.Structure and expression strategy of the genome of Culex pipiens densovirus，a mosquito densovirus with an ambisense organization［J］.J Virol，2009，83(13):6863-6873.