生物学效应分析—心理性应激和躯体性应激对鼠脾杀伤细胞影响的异同

王佐周，聂影，傅炜昕，孙赞，崔敬惠，梁再赋*

(1.中国医科大学基础医学院病理教研室，辽宁沈阳110001;2.中国医科大学实验技术中心暨国家中药管理局中药生物工程实验室(Ⅲ级)，辽宁沈阳110001)

NK细胞、CTL细胞是机体免疫的主要杀伤细胞，研究表明，应激可降低杀伤细胞功能，但其详细机制尚不清楚，特别是尚未见到从心理性应激(phsychological stress)和躯体性应激(physical stress)对杀伤细胞活性的影响异同角度进行研究的报道。本实验选用应激动物模型，观察了心理性应激和躯体性应激对鼠脾NK、LAK(Lymphokine-activad Killer cell)、CTL细胞杀伤活性的影响，以阐明心理性应激和躯体性应激降低鼠脾杀伤细胞杀伤活性的机制及异同。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物8周龄C57BL/6纯系雌性小鼠购于日本クレァ会社，在空气控制级别为SPF级，室温(23±1)℃，湿度(55±5)%，明暗条件12 h转换(6点开灯，18点熄灯)的环境下，观察饲养1周后用于实验。观察饲养及正常实验期间任其自由摄取无菌食物和水。实验动物随机分成心理性应激组、躯体性应激组和非应激对照组3组，每组7只。

1.1.2 试剂与仪器51Cr-铬酸钠购于美国NEN公司;人类重组IL-2(rIL-2)由Takeda化工会社(日本)友情赠送。

1.2 方法

1.2.1 应激负荷法使用Communication box系统(MUROMACHI KIKAI CO.，LTD日本)负荷应激，箱内部由透明的聚丙烯板分为4个A区(底部敷设塑料板)和5个B区(底部敷设金属格子)。放入B区的小鼠由于足部受到电击，出现跳跃、排便、嘶叫及气味等应激反应。与此相对，A区内的小鼠虽然没有受到直接的电击刺激，但由于暴露于B区小鼠的应激反应环境中而受到心理性应激刺激。本研究通过对B区内的小鼠施加0.6 mA的电流刺激，刺激时间1 s，1 h内共120 s的随机性电刺激使B区和A区的小鼠分别负荷躯体性应激和心理性应激刺激。

1.2.2 脾细胞悬液的制备在连续负荷应激3 d后(AM10.00)，腹腔注射10%巴比妥钠0.2 mL而处死，无菌取脾，研碎，200目钢网滤过，以得到单个脾细胞。离心，弃上清，沉淀中加入0.83%Tris-NH4Cl液溶解红细胞后，以1640液洗涤2次，用10%FCS-1640培养液调整浓度为2.5×107备用。

1.2.3 杀伤细胞活性测定采用微量51Cr-铬酸钠释放法测定NK、LAK及CTL细胞活性。①鼠LAK细胞的诱导:取2×106/mL脾细胞1 mL加入12孔培养板中，用含有575 u/mL的rIL-2的RPMI-1640培养液于37℃、5%CO2条件下培养120 h。以1640液洗涤4次，用10%FCS-1640培养液调整浓度为2.5×107备用;②CTL细胞的诱导:致敏靶细胞制备:取对数生长期的YAC-1细胞，用1640液洗涤2次，用1640液调整细胞浓度为1×107/mL，以Mitomycin C 100 μg/mL(Sigma)37℃处理30 min后，用1640液洗涤4次，以10%FCS-1640培养液调整细胞浓度为1×107/mL;CTL细胞的诱导:把C57BL/6(H-2b)小鼠脾细胞以5×106/mL浓度与Mitomycin C处理的致敏YAC-1细胞(H-2a)以105/mL的浓度按50∶1的比率在37℃、5%CO2条件下培养5 d后，以1640液洗涤4次，用10%FCS1640培养液调整浓度为2.5×107/mL备用;③靶细胞的标记:取对数生长期的YAC-1细胞，用1640液洗涤2次，用10%FCS1640培养液调整细胞浓度为1×107/mL，0.1 mL YAC-1细胞悬液加3.7 MBq(100 uci)51Cr，5%CO2条件下孵育60 min，每隔15 min振荡1次。1640液洗涤4次，以洗去未标记的游离51Cr;④杀伤活性测定:取靶细胞0.1 mL(1×105/mL)加入96孔圆底微量板中，然后加入不同比例的效应细胞0.1 mL，使E/T(效应细胞/靶细胞)比率分别为100∶1、50∶1和25∶1，一式3份，同时设自然释放孔(0.1 mL靶细胞+0.1 mL 10%FCS RPMI-1640)和最大释放孔(0.1 mL靶细胞+0.1 mL 0.2%TritorX)，37℃，5%CO2条件下孵育4 h。将微量板以1 500 r/min离心5 min，吸取各孔上清0.1 mL加于计数管内，以自动计数仪(1470WiandTM，perkin Elmer)测定cpm值/min。根据下式计算细胞毒活性:细胞毒活性(%)=(实验组cpm值-自然释放组cpm值)/(最大释放组cpm值-自然释放组cpm值)×100%。

1.2.4 统计学处理结果以¯χ±S表示，组间比较采用方差分析，统计软件SPSS 10.0。

2 结果与分析

2.1 心理性和躯体性应激对小鼠脾NK细胞杀伤活性的影响

实验结果显示，负荷心理性应激和躯体性应激3 d后与对照组比较，两者在效/靶比例为1∶50、1∶100时均可降低鼠脾NK细胞杀伤活性(P＜0.01)。但2种应激反应对NK细胞活性的影响无显著差异(表1)。

2.2 心理性和躯体性应激对小鼠脾LAK细胞杀伤活性的影响

如表2所示，E/T比率为1.25时，与对照组比较两者明显降低小鼠LAK细胞活性(P＜0.01)，但这2种应激反应对LAK细胞活性的影响无显著差异(表1)。

2.3 心理性和躯体性应激对小鼠脾CTL细胞杀伤活性的影响

如表3所示对照组比较，心理性应激和躯体性应激都可明显降低C57BL/6小鼠脾CTL细胞活性(P＜0.001)，躯体性应激比心理性应激对CTL细胞活性有较强的抑制作用(P＜0.05)。

表1 应激对小鼠脾NK细胞活性的影响(%)Table 1 Effects of stress on activity of splenic NK cell in C57BL/6 mic(%)

表2 应激对小鼠脾LAK细胞活性的影响(%)Table 2 Effects of stress on activity of splenic LAK cell in C57BL/6 mic

表3 应激对小鼠脾CTL细胞活性的影响(%)Table 3 Effects of stress on activity of splenic CTL cell in C57BL/6 mic(%)

3 讨论

应激(stress)是机体在对生存环境中多种不利因素适应过程中，实际或认知上的要求与适应和应付能力之间不平衡导致的身心紧张状态及其反应。其主要特征为机体受到内外环境刺激后发生下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴及交感肾上腺髓质活性增强。研究表明，应激主要通过间接途径激活室旁核分泌促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)，从而促进肾上腺皮质激素(ACTH)的大量分泌。而ACTH的升高与肿瘤的发生密切相关。应激还可通过抑制免疫功能［1-2］，使机体易发感染、自身免疫性疾病和肿瘤等疾病［3-4］。

NK细胞是固有免疫的主要细胞，属于淋巴细胞谱系细胞群，通过分泌细胞毒性颗粒无需致敏就可直接杀伤肿瘤和病毒感染靶细胞或通过分泌多种细胞因子调节其他免疫细胞的免疫功能，参与免疫系统的发生、发展及效应等重要环节的调节过程。NK细胞与靶细胞结合后，以Fas/FasL途径和释放穿孔素(Perforin)、颗粒性溶解酶(Granzyme)、颗粒性溶解素(Granulysin)2种方式诱导靶细胞发生凋亡而杀伤靶细胞［5-7］。

研究已经发现:慢性应激可显著降低鼠脾NK细胞的杀伤活性，减少脾NK细胞的数量［8］;癌症病人在外科手术的应激下，NK细胞数量和活性均下降［9］。在对创伤后应激障碍的退伍军人的研究中发现［10］:其NK细胞的细胞毒性显著下降。以上研究均表明，应激可以抑制NK细胞功能，但生理和心理应激对NK细胞作用的差别却未见报道。

有研究证实，应激种类的不同，脑赋活的经络也有所不同。心理性应激时，首先兴奋大脑皮质和边缘系，其信息传递至扁桃体中心核(Ace)和分界条床核(BST)激活丘脑下部室旁核(PVN)及PHA轴，Ace、BST及PVN等也投射至脑干的植物神经核，参与应激，导致植物神经症状的表现。而末梢的炎症等躯体性应激刺激，其变化经血行性脑弓下器官最后传递至脑;对生命有威胁的躯体性应激，其末梢信息直接传递至PVN。因而，在研究应激对免疫功能的影响时，比较生理和心理应激反应间的差别是重要的。

本实验选用应激动物模型，观察了躯体性应激和心理性应激对鼠脾NK、LAK、CTL细胞杀伤活性的影响，结果显示躯体性应激和心理性应激可导致鼠脾NK细胞、LAK细胞杀伤活性降低;迄今为止，仍无关于心理应激反应影响LAK细胞活性的报道。

躯体性应激和心理性应激两者均可明显降低CTL细胞活性，与文献报道一致［11］。实验结果显示，躯体性应激比心理性应激对CTL细胞活性有较强的抑制作用。

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