棉粕源生物蛋白饲料底物辅料组成的优化

冯莉,张文举,于磊,石国庆,2

(1石河子大学动物科技学院,石河子832003;2新疆农垦科学院绵羊繁育与生物技术重点实验室,石河子832000)

棉粕源生物蛋白饲料底物辅料组成的优化

冯莉1,张文举1,于磊1,石国庆1,2

(1石河子大学动物科技学院,石河子832003;2新疆农垦科学院绵羊繁育与生物技术重点实验室,石河子832000)

为了优化棉粕源生物蛋白饲料底物辅料的组成,试验采用9因子12水平均匀设计法,通过测定发酵产物中游离棉酚(FG)含量和活性酵母菌数,对热带假丝酵母(Candida tropicalisZD-3)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeZD-5)对棉粕源基础底物复合发酵的底物辅料组成进行研究。应用DPS7.05统计软件分析试验数据,建立回归模型,获得优化结果。结果显示,底物辅料组成的优化组合为:鱼粉5.99 g/100g,尿素1.05 g/100 g,糖蜜2.09 g/100g,甘露糖0.73 g/100g,硫酸镁0.39 g/100g,氯化钠 0.64 g/100g,K2HPO4/KH2PO40.40 g/100 g,CaHPO41.60 g/100g,硫胺素 0.56 mg/kg。

棉粕;热带假丝酵母;酿酒酵母;复合发酵;生物蛋白饲料;辅料组成

棉籽饼粕是棉花加工业的主要副产品,粗蛋白含量为30%～45%,是我国重要的植物性蛋白饲料资源。棉籽饼粕可安全的且以较大比重替代豆粕应用于反刍动物,尤其是在奶牛饲养中已大量地推广应用。但是对单胃动物而言,饲喂棉籽饼粕时,棉籽饼粕中含有对动物机体有毒害作用的游离棉酚(free gossypol,FG),会对动物生长、发育和繁殖等方面产生明显的不良影响[1-4],从而限制了其在畜牧生产上的大量应用[5-7]。利用微生物发酵脱毒的方法[8-9]可以达到消除游离棉酚对家畜毒害作用的目的,提高棉籽饼粕利用率。1925年,Eckles发现生物活性蛋白饲料-复合酵母培养物(yeast culture,YC)可促进了动物的生产性能[10]。本研究的目的是将酵母培养物的生物学特性与新疆丰富棉粕资源的脱毒利用有机地结合起来,对其进行开发。但直到最近的20年,国外 YC的相关研究报道才开始增多,主要是关于 YC对反刍动物的作用效果[11-15]。

本研究拟在前期发酵条件参数优化的基础上,对底物辅料组成进行优化。因为底物是微生物的营养源,底物中不同的氮源、碳源、无机矿物质以及硫胺素等养分都会显著影响酵母菌的生长和FG的消除,以及生物发酵饲料的品质。试验采用9因子12水平均匀设计(uniform design)法,通过测定发酵产物中FG含量和活性酵母菌数,确定脱毒效率高、活性酵母菌含量多的棉粕源生物蛋白饲料底物辅料组成参数,以期为生产优质生物发酵饲料奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料

棉粕:产地为新疆石河子,将其粉碎,过 60目筛,其干物质中粗蛋白(CP)含量43.3%、FG 301.9 mg/kg。

基础底物组成:棉粕58%、豆粕5%、玉米蛋白粉9%、玉米20%、麦麸 8%。底物以棉粕为主要成分(58%),通过豆粕等其它原料调节必需氨基酸比例,配制必需氨基酸相对平衡(接近NRC(1998)鸡理想氨基酸模式)[16]的基础底物。主要借助 Excel 2003较件和中国饲料成分及营养价值表(2007)[17]完成。该底物含CP 36%,FG179.5 mg/kg。

菌株:热带假丝酵母ZD-3、酿酒酵母ZD-5均由浙江大学饲料科学研究所选育提供。

斜面培养基:麦芽汁质量分数5.0%,琼脂2.0%,在0.056 MPa条件下,112.6℃灭菌20 min。

种子培养液:麦芽汁质量分数5%,在0.056 MPa条件下,112.6℃灭菌20 min。

1.1.2 主要仪器和试剂

722型可见光分光光度计;超净台、隔水式恒温培养箱、HH型电热恒温水浴锅;生物恒温摇床;分析天平;高压灭菌锅;移液枪等仪器;异丙醇、正己烷、冰醋酸、苯胺、3-氨基-1-丙醇、锌粉等试剂。

1.2 方法

1.2.1 种子液培养

将热带假丝酵母ZD-3(或酿酒酵母ZD-5)分别接入麦芽汁斜面培养基,30℃培养72 h,挑取一环菌苔接入5 mL麦芽汁,在试管中30℃,150 r/min摇动培养24 h(一级菌种),取1 mL一级菌种接入20 mL麦芽汁,在100 mL三角瓶中30℃,150 r/min摇动培养20 h(二级菌种)。根据试验需要可按上述方法等比例扩培所需菌种液。

1.2.2 生物蛋白饲料底物辅料组成的优化方法

采用9因子12水平均匀设计方法优化底物辅料组成。底物组成是在棉粕源基础底物中添加如下9种辅料成分,包括鱼粉、尿素、糖蜜、甘露糖、硫酸镁、氯化钠、磷酸氢二钾/磷酸二氢钾(等量混合物)、磷酸氢钙和硫胺素等9个因子,因子和水平详见表1。根据DPS 7.05软件[18]中的均匀设计法得到9因子12水平均匀设计表U12(129)(表2),利用该表来安排试验处理,每个处理3个重复,共计36个样本。测定指标为发酵产物中FG含量和酵母菌数。

表1 生物蛋白饲料底物辅料组成优化的因子与水平Tab.1 Factors and levels of the ptimization of supplementary material in substrate for biological protein feed

1.2.3 发酵方法

称取底物100 g放入500 mL三角瓶中混合均匀,然后以初始底物水分40%的比例,用蒸馏水调湿,0.056 MPa,112.6℃蒸汽灭菌20 min,冷却后按接种量8 mL/100 g、接种比例3∶7,接入热带假丝酵母ZD-3和酿酒酵母ZD-5二级种子液,搅拌均匀,三角瓶四层纱布封口,32℃恒温静止培养48 h。发酵结束后,将发酵产物放入烘箱中,45℃烘干48 h,冷却粉碎,过60目筛,装入样品袋,保存于4 ℃冰箱中待测。

表2 生物蛋白饲料底物辅料组成优化的均匀设计表U12(129)Tab.2 Uniform design table of the optimization of supplementary material in substrate for biological protein feed,U12(129)

1.2.4 指标测定方法

游离棉酚的测定方法:按照国标 GB13086-91,饲料中游离棉酚的测定方法。

酵母菌数测定方法:平板计数法。按照国标G B4789.15-84,食品卫生微生物检验-霉菌和酵母计数。

1.2.5 试验数据统计方法

应用DPS7.05统计软件中的二次多项逐步回归分析法对生物蛋白饲料底物辅料组成优化的试验结果(游离棉酚和酵母菌数)分别进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 以酵母菌数为依变量的回归分析

以酵母菌数为目标函数 Yyeast,用 DPS 7.05软件对表3酵母菌数和因子水平的试验数据进行二次多项逐步回归分析,得到如下二次多项回归方程:

Yyeast=0.95-1.04X2+28.07X6+3.20X9+16.73X62+0.087X82+2.15X1X7+0.30X1X8-0.87 X3X4+4.37X3X5-16.88X6X9(×108cfu/g)。 (1)

统计分析结果(表3)表明,该方程的决定系数R2=1.00,表明该回归方程与试验结果符合度极好,能够准确表达各自变量与因变量酵母菌数的关系。变量 X2、X3X4、X6X9与 Yyeast(酵母菌数)呈负相关,其偏相关系数均为 -1,差异极显著(P<0.01)。其它变量 X6、X9、X62、X82、X1X7、X1X8、X3X5与 Yyeast呈正相关,它们的偏相关系数均为1,差异极显著(P<0.01)。

表3 生物蛋白饲料底物辅料组成的优化试验结果Tab.3 The optimization result of supplementary material in substrate for biological protein feed

根据该二次多项回归方程,DPS 7.05软件拟合的Yyeast最高指标时各个因素组合为:X1(鱼粉)5.98 g/100 g、X2(尿素)0 g/100 g、X3(糖蜜)0.17 g/100 g、X4(甘露糖)1.46 g/100 g、X5(硫酸镁)0.38 g/100 g、X6(氯化钠)0.64 g/100 g、X7(K2HPO4/KH2PO4)0.4 g/100 g、X8(CaHPO4)1.6 g/100 g、X9(硫胺素)0 mg/kg。

2.2 以FG为依变量的回归分析

以发酵产物中FG含量作为目标函数YFG,采用DPS 7.05统计软件对表6中FG和因子水平数据进行逐步回归分析,得到如下二次多项回归方程:

经统计分析,该方程的决定系数 R2=1.00,表明该回归方程与试验结果符合度极好,能够准确表达各自变量与因变量YFG游离棉酚含量的关系。各变量与依变量 YFG的偏相关系数分别为:X3(1)、X1X2(0.9999)、X4X5(0.9999)、X4X6(1)、X6X7(0.999),与 FG含量呈正相关,差异极显著(P<0.01);变量 X6、X82、X1X3、X2X3、X5X7与依变量YFG的偏相关系数均为-1,呈负相关,差异极显著(P<0.01)。

根据该二次多项回归方程(2),DPS 7.05统计软件拟合的 YFG最低指标时各个因素组合为:X1(鱼粉)6.0 g/100 g、X2(尿素)2.1 g/100 g、X3(糖蜜)4.0 g/100 g、X4(甘露糖)0 g/100 g、X5(硫酸镁)0.4 g/100 g、X6(氯化钠)0.64 g/100 g、X7(K2HPO4/KH2PO4)0.4 g/100 g、X8(CaHPO4)1.6 g/100 g、X9(硫胺素)1.11 mg/kg。

2.3 棉粕源生物蛋白饲料底物辅料组成比例的确定

发酵产物中酵母菌数越多而 FG含量越少越好,而2个指标的试验结果不完全一致,因此取二者平均值作为辅料组成优化结果。棉粕源生物蛋白饲料底物辅料组成比例如下:X1(鱼粉)5.99 g/100 g、X2(尿素)1.05 g/100 g、X3(糖蜜)2.09 g/100 g、X4(甘露糖)0.73 g/100 g、X5(硫酸镁)0.39 g/100 g、X6(氯化钠)0.64 g/100 g、X7(K2HPO4/KH2PO4)0.4 g/100 g、X8(CaHPO4)1.6 g/100 g、X9(硫胺素)0.56 mg/kg。我们发现X1(鱼粉)、X5(硫酸镁)、X6(氯化钠)、X7(K2HPO4/KH2PO4)和X8(CaHPO4)等5个因子,它们根据酵母菌数和FG含量2个指标的优化结论几乎是一致的,均为取试验水平设置的最大值。根据所确定的辅料组成比例和回归方程(1)、(2),计算得出的发酵底物酵母菌数和FG含量预测值分别为:

Yyeast=30.9×108 cfu/g;YFG=-14.2 mg/kg,其中FG含量为负值,但是现实中不可能存在,只是表明底物中FG含量会很低。

3 讨论

底物中添加动物氮源鱼粉和有机氮源尿素的目的是探讨不同氮源对酵母菌生长和脱毒的影响。鱼粉中所含的氨基酸比例平衡,有利于微生物的增殖;鱼粉蛋白质中赖氨酸的游离氨基可和棉酚的活性醛基反应形成结合棉酚,从而达到脱毒的目的。由于底物中含有丰富的氨基酸氮源,所以添加尿素不能促进酵母菌的增殖,但由于尿素的胺基可和棉酚的活性醛基形成结合棉酚,所以添加尿素有利于脱毒,这与试验结论一致。底物中添加糖蜜、甘露糖等主要是为酵母菌提供可发酵糖源;硫酸镁、氯化钠以及磷酸盐,是微生物增殖不可缺少的矿物质;而硫胺素是酵母细胞壁的重要组成成分。

4 结论

利用热带假丝酵母与酿酒酵母复合发酵生产棉粕源生物蛋白饲料,底物辅料组成的优化结果为:X1(鱼粉)5.99 g/100 g、X2(尿素)1.05 g/100 g、X3(糖蜜)2.09 g/100 g、X4(甘露糖)0.73 g/100 g、X5(硫酸镁)0.39 g/100 g、X6(氯化钠)0.64 g/100 g、X7(K2HPO4/KH2PO4)0.4 g/100 g、X8(CaHPO4)1.6 g/100 g、X9(硫胺素)0.56 mg/kg。

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Optimization of Supplementary Material in Substrate for Biological Protein Feed from Cottonseed Meal during Solid State Fermentation

FENG Li1,ZHANG Wenju1,YU Lei1,SHI Guoqing1,2
(1 College of Animal Science and Technology,Shihezi University,Shihezi 832003,China;2 Key Laboratory of Sheep Breed and Biotechnology,Xinjiang Academy of Agricultural Reclamation Sciences,Shihezi 832000,China)

The purpose of this study was to optimize the supplementary material in substrate for biological protein feed from cottonseed meal during solid state fermentation.The uniform design of 9 factors and 12 levels was applied by measuring the free gossypol and yeast content of fermented product,to optimize the supplementary material composition in medium during solid state fermentation withCandida tropicalisZD-3 andSaccharomyces cerevisiaeZD-5.The experimental data was analyzed to obtain the regression model and the optimal supplementary material composition was achieved by optimization with DPS7.05 software.The optimal supplementary material consisted of 5.99 g/100g fish meal,1.05 g/100g urea,2.09 g/100g molasses,0.73 g/100g mannose,0.39 g/100g MgSO4,0.64 g/100g NaCl,0.4 g/100 g K2HPO4/KH2PO4,1.6 g/100 g CaHPO4and 0.56 mg/kg thiamine.

cottonseed meal;Candida tropicalis;Saccharomyces cerevisiae;mixed culture fermentation;biological protein feed;supplementary material in substrate

S831.5

A

1007-7383(2011)02-0184-05

2010-09-25

国家自然科学基金项目(30960258),新疆兵团科技攻关计划项目(2007ZX02)

冯莉(1986-),女,硕士生,专业方向为饲料资源的开发与利用:e-mail:fengli1124@126.com。

张文举(1966-),男,教授,博士,从事饲料资源的开发与利用的研究;e-mail:zhangwj1022@sina.com。