菌渣固态发酵菌体蛋白饲料的工艺优化

张婷婷+马磊

摘要：为了综合利用菌渣废弃物，采用酵母菌协同固态发酵技术，探究将食用菌多糖提取废渣转化为蛋白饲料的工艺条件。从不同基质、温度、水料比、发酵时间4个方面，分析影响固态发酵菌渣转化蛋白的因素，并通过正交试验优化菌渣固态发酵工艺。结果表明，影响蛋白质含量的主次因素依次为基质配比>发酵时间>温度>水料比；在酵母菌接种量13%条件下，菌渣与麸皮的适宜质量比8 ∶2、水料比1 mL ∶2.5 g、30 ℃下培养96 h，此时发酵物的粗蛋白含量可达峰值18.43%。本研究将废弃菌渣转化高蛋白的方法，可促进菌渣的再利用，为高效资源循环使用奠定基础。

关键词：菌渣，固态发酵，蛋白饲料，正交设计

中图分类号： S816.4 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）09-0270-02

菌渣废弃物一般富含水分、易腐烂、不易保存，直接排放污染环境。随着经济的快速发展和人们生活水平日益提高，畜牧产品需求增大，致使饲料缺口逐年增加，出现了供求关系难以平衡的局面[1]。因而，寻求新蛋白源成为饲料科学中的一项重要课题[2]。目前，运用微生物发酵生产蛋白饲料越来越受重视[3-4]。本研究探讨不同基质配比、不同温度、不同料水比以及不同培养时间对酵母菌发酵蛋白质含量的影响，并在单因素试验的基础上，采用正交试验法对菌渣固态发酵菌体蛋白饲料的工艺进行优化。

1 材料与方法

1.1 材料

酵母菌、提取金顶侧耳菌菇多糖后残留菌渣、麸皮、马铃薯浸取液、葡萄糖、琼脂粉、玉米粉、浓硫酸、硫酸钾、硫酸铜、40 % NaOH溶液、HCl溶液、混合滴指示剂（0.1%甲烯蓝 ∶0.1% 甲基红=1 ∶4）。

1.2 方法

1.2.1 基础培养基的制备

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：自制马铃薯浸取液1.0 L，加入琼脂粉15.0 g，葡萄糖20.0 g，121 ℃灭菌25 min后，取出斜面放置，冷却备用。

固态发酵培养基：分别以菌渣、菌渣+麸皮、菌渣+玉米粉为培养基基质，添加一定量的水分、配制成用于考察水料质量比（简称水料比）、发酵温度、发酵时间对发酵产物蛋白含量影响的不同培养基，于121 ℃灭菌25 min 。

1.2.2 菌种的活化

在无菌条件下，将酵母菌种接种到PDA斜面培养基上，放置恒温箱内，在30 ℃下恒温培养，活化72 h，得到优质菌种。

1.2.3 液体种子培养

在无菌条件下，用10 mL无菌水冲洗斜面培养基上已活化的菌种，接种至盛有80 mL 液体种子培养基的三角烧瓶中，置于摇床中，在30 ℃、160 r/min的条件下振荡培养72 h。

1.2.4 固体发酵培养

在无菌条件下，将酵母菌以13% 的接种量接种到已灭菌的固体发酵培养基中，置于25～40 ℃恒温箱中培养72 h。待培养结束后，将培养物置于50 ℃烘箱中风干，测粗蛋白质含量。基础对照为未发酵样品，将试验所用的金顶侧耳菌菇多糖提取后的残渣在50 ℃条件下烘干，随机称取0.2 g未经酵母菌发酵样品，测定其蛋白质含量。

1.2.5 粗蛋白质含量的测定

采用微量凯氏定氮法测定粗蛋白质含量。将发酵好的培养基烘干至恒质量，称取0.2 g烘干后的培养基，放入干燥的消化管中，再加入0.4 g的混合催化剂后，加入20 mL 的浓硫酸。待消化管中液体冷却后，加入蒸馏水20 mL，进行蒸馏，在接收瓶中加入2% H3BO350 mL 和2～3滴指示剂，用0.05 mol/L HCl 滴定接收瓶内的溶液，滴定溶液由绿色变成淡紫色或灰色时为滴定终点，记下消耗HCl的体积（mL），计算粗蛋白质含量。

1.2.6 正交试验设计

在单因素试验的基础上，采用L9（34）正交试验法对基质配比、温度、水料比以及培养时间这4个影响因素进行优化，每组试验重复3次，正交试验因素水平见表1。

2 结果与分析

本研究探讨了不同基质配比、不同温度、不同水料比以及不同培养时间对酵母菌发酵蛋白质含量的影响，并在单因素试验的基础上，采用L9（34）正交试验法对基质配比、温度、水料比以及培养时间4个因素进行优化。

2.1 不同基质配比对粗蛋白含量的影响

由图1可知，优化后的蛋白含量显著高于未发酵样品的蛋白含量（7.8%）。在1 mL ∶2.5 g的水料比、13% 接种量、30 ℃培养96 h条件下，不同基质配比所获蛋白质含量呈现显著差异。当菌渣与麸皮以质量比9 ∶1的比例混合时，粗蛋白质含量可达最高值（18.3%），与纯菌渣组和质量比9 ∶1菌渣玉米粉组呈现显著差异。这可能是因为在培养基的发酵体系中，麸皮含有较丰富的营养组分，其所含糖分、蛋白质、维生素和矿物质等都是菌种发酵所必需的物质。因此，添加麸皮有利于菌体生长。同时，麸皮质地粗糙，能增强物料通透性，促进菌生长。添加玉米粉的培养基，粗蛋白质含量增加不明显，仅为12.1%，这可能是由于玉米粉颗粒较细，易使培养基黏性大、结块、通透性差，从而不利于菌体生长。

2.2 不同温度对粗蛋白含量的影响

图2显示，在1 mL ∶2.5 g的水料比、13%接种量、菌渣和麸皮质量比9 ∶1、培养96 h的条件下，不同温度下所获蛋白质含量呈显著差异。蛋白质含量随温度升高而增加，当温度为30 ℃ 时，蛋白质含量达最高值，30 ℃也是酵母菌体较为适宜的生长温度。当温度升至35 ℃时，蛋白质含量开始随温度升高而降低，这可能是由于温度过高，加快了发酵物的水分蒸发，造成了不利于菌体生长的环境，从而降低蛋白质含量。

2.3 不同水料比对粗蛋白含量的影响

菌体的生长需要适宜的水分，固态发酵物料中的含水量是影响蛋白质产量的重要因素之一。由图3可知，在菌渣和麸皮质量比9 ∶1、13%接种量、30 ℃培养96 h条件下，不同水料比会使蛋白质含量呈显著现差异。水料比为1 mL ∶1.0 g时，粗蛋白含量最低，仅有10.8%；当水料比为1 mL ∶2.5 g时，粗蛋白质含量高达17.7%；当水料比为1 mL ∶3.0 g时，粗蛋白量降低至15.3%。基质水分过多，培养基易黏结，多孔性降低，通透性削弱，基质易变质，杂菌易污染；含水量过低，则会降低培养基的膨胀程度，妨碍菌体利用基质营养，从而影响菌体生长，导致菌体生长不完全，蛋白质含量低。

2.4 不同发酵时间对粗蛋白含量的影响

由图4可知，在1 mL ∶2.5 g的水料比、菌渣和麸皮质量比9 ∶1、13%接种量、30 ℃培养条件下，不同发酵时间下蛋白质含量呈现显著差异。发酵初始，粗蛋白含量随时间增加而增长，当发酵 96 h 时粗蛋白含量高达 17.6%；随着发酵时间延长至120 h，蛋白质含量降低至15.7%。由此可见，当发酵24 h时，菌体没有达到完全生长，随着时间的延续，菌体逐渐成熟。在发酵96 h时，菌体生长最佳。发酵120 h后，菌体有可能已经完成了生长周期，表现出衰退或死亡的现象，并引起菌体的自溶现象，从而降低粗蛋白含量。

2.5 固态发酵条件的正交优化

在单因素试验的基础上，采用L9（34）正交试验法对基质配比、温度、水料比以及培养时间这4个影响因素进行优化，结果见表2。极差分析结果显示，影响粗蛋白含量影响因素主次顺序分别为基质配比>发酵时间>温度>水料比；方差分析结果也显示，基质配比是影响粗蛋白含量的主要因素。固体发酵菌渣蛋白饲料工艺中的最优组合为A3B2C1D3，即在酵母菌接种量13%条件下，菌渣 ∶麸皮质量比为8 ∶2、水料比1 mL ∶2.5 g、30 ℃下培养96 h，发酵物的粗蛋白含量可达18.43%。

3 结论与讨论

本研究分析了固态发酵菌体蛋白饲料的生产工艺，研究各因素对蛋白质含量影响的主次顺序，并通过正交试验优化菌渣固态发酵菌体蛋白饲料工艺。试验结果表明，影响蛋白质含量的主次因素依次为基质配比、发酵时间、温度、水料比。在酵母菌接种量13%条件下，菌渣 ∶麸皮质量比为8 ∶2、水料比1 mL ∶2.5 g、30 ℃下培养96 h，发酵物的粗蛋白含量可达峰值（18.43%）。

本试验所用菌渣是金顶侧耳菌菇多糖提取后的废料，具有一定水分，易腐烂发臭，不易保存，如果直接排放会造成环境污染。菌渣含有比较丰富的营养物质[5]。试验前测得未经固体发酵的菌渣粗蛋白质含量约为7.8%，条件优化后蛋白含量升高到18.43%。因而，以菌渣作为发酵的主料，再添加一些辅料，采用酵母菌协同固态发酵技术，可将菌残渣转化为蛋白含量较高的饲料，能大幅提高饲料的营养价值，从而建立高效的资源循环再利用系统。

参考文献：

[1]孔平涛. 我国饲料蛋白原料现状与发展需求[J]. 饲料广角，2003，23（18）：15-18.

[2]李志香，王一鸣. 废菌渣开发饲料蛋白质替代源的菌种筛选与多菌共同发酵[J]. 中国畜牧兽医，2007，34（4）：19-22.

[3]王淑军，吕明生，王永坤. 混菌发酵提高甘薯渣饲用价值的研究[J]. 食品与发酵工业，2002，28（6）：40-45.

[4]赵凤敏，李树君，方宪法，等. 中心组合设计法优化马铃薯薯渣固态发酵工艺[J]. 农业机械学报，2006，37（8）：45-48.

[5]马纯艳，王升厚. 菌糠单细胞蛋白饲料生产技术的研究[J]. 食用菌，2005，27（3）：56-58.