利用分子标记建立杂交小麦亲本分子指纹图谱

李青燕+陈向东+董娜+李淦+茹振钢

摘要：表达序列标签-微卫星DNA（EST-SSR）、序列标志位点（STS）是基于特异引物PCR技术的分子标记，具有共显性遗传、位点数量多、多态性高、稳定性好等优点，广泛地应用于指纹图谱构建、品种鉴定等方面。选用小麦低温敏雄性不育系BNS和来自不同生态区的7个小麦品种（系），从192对引物中筛选出条带清晰、多态性丰富、覆盖小麦所有染色体的21对引物，在8个小麦品种（系）中扩增出72个等位位点，每个引物扩增出的位点数2～7个，平均3.43个；基因多样性指数变幅为0.218 8～0.843 8，平均值为0.544 3；每个引物的多态性信息含量（PIC值）的变化范围在0.194 8～0.824 7之间，平均值0.495 7。由结果可以看出，引物SWES33、CFE11、CFE188、CFE138扩增出来的带型多，易于进行品种的鉴定和区分，其中引物SWES33和CFE11结合起来，可以将这8个小麦品种区分开，这为BNS型杂交小麦品种的鉴定工作提供了依据。

关键词：小麦；BNS；分子标记；指纹图谱

中图分类号： S512.103.2 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）09-0032-03

小麦是我国主要的粮食作物之一。随着社会的进步、人们生活水平的提高，对小麦的要求变得更高，不仅要求小麦高产，而且对小麦的品质也要求达到优质。为了满足人们的需求，育种家开始研究优质、高产的小麦品种，通过杂交等方法使优良的小麦基因集中到一起而培育高产优质的小麦品种。但是，在新品种培育过程中，含有优良基因的小麦亲本的反复利用，使小麦的遗传多样性降低，新品种之间的相似性变高，对小麦新品种的鉴定带来了很大的困难。对小麦品种鉴定和认证的传统方法是采用形态学标记，但是该方法易受外界因素的影响，结果准确性较差，随后发展的细胞学标记、生化标记也易受到各种因素的影响，直到分子标记的出现并成为一种广泛应用的方法。分子标记的方法有微卫星DNA（simple sequence repeats，SSR）、序列标志位点（sequence tagged site，STS）、表达序列标签（experssed sequence tags，EST）、限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、特定序列扩增（sequence characterized amplified regions，SCAR）等。EST-SSR是从EST序列中开发的一种新型SSR标记。EST-SSR和STS是基于特异引物PCR技术的分子标记，具有共显性遗传、位点数量多、多态性高、稳定性好等优点。目前，很多作物如大麦[1-2]、小麦[3]、葡萄[4]等的SSR标记已被用于遗传作图、遗传多样性、比较作图、品种指纹图谱等研究中。另外，还有一些学者利用分子标记构建农作物的分子身份证，用于农作物品种纯度鉴定，例如聂新辉等利用40对引物完全区分开新陆早51份常规品种，并可用于构建供试品种的指纹图谱[5]；陆徐忠等采用SSR标记与商品信息相结合的方法构建水稻品种身份证，有利于了解品种信息，方便品种的管理等[6]；颜静宛等构建了137个水稻品种材料24个标记的分子身份证数据库[7]；李伟忠等利用64对SSR引物对257份玉米自交系建立了分子身份证[8]；巫桂芬等利用相关序列扩增多态性（sequence related amplifedpolymorphism，SRAP）、简单重复序列区间扩增（inter simple sequence nepeat，ISSR）、SSR标记绘制了154份黄麻品种基因组DNA分子指纹图谱[9]。但是构建小麦分子身份证的研究很少，因此，本研究采用EST-SSR和STS分子标记，对部分BNS型杂交小麦亲本进行遗传多样性分析，构建小麦分子身份证，有利于小麦品种的收集和保存，同时也为育种家亲本选配提供有力依据，加速育种进程。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用来自不同地区的8份小麦材料，其种子均由河南科技学院小麦中心提供。包括黄淮地区的BNS、周麦18，西南地区的川麦107，西北地区的新春6号，长江流域的浙丰2号，东北地区的小冰麦33，国外的CL0433（智利）、FRA01（法国）。

1.2 DNA的提取

在小麦4～5叶期时取幼苗叶片，通过CTAB法提取其 DNA[10]。

1.3 SSR检测

本试验所用引物SWES[11]、CFE[12]和Xmag（http：//avena.pw.usda.gov）均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。对供试品种进行PCR扩增，PCR扩增产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳（每次的点样顺序都是固定的，即品种顺序固定），电泳结束后显影。显影的方法：（1）银染：将其放入600 mL 蒸馏水+0.6 g硝酸银溶液中浸泡15 min；（2）水洗：迅速放入蒸馏水中冲洗；（3）显影：放入500 mL蒸馏水+8 g NaOH+0.3 g Na2CO3+4 mL甲醛溶液中，直至出现带型即可。拍照并记录位点数。

1.4 数据处理

带型的记录参考颜静宛等的方法[7]，根据带型（基因型）：记录每1个引物在8个品种（系）中扩增的带型，相同带型（相同的基因型） 代号相同，不同带型（不同的基因型），依次记作 1，2，3，…，n。

利用PowerMarker V3.25 软件计算不同引物的基因多样性指数及多态信息含量（PIC值）。

1.5 小麦分子身份证的初步构建

根据带型记录电泳结果，8个小麦品种以BNS作为对照品种，由对照品种扩增出的带型标记为1，其他品种扩增出的带型，与对照品种相同的同样标记为1，不同的标记为2，与带型2不同的标记为3，依此类推。得到8个小麦品种由21对引物扩增出的基因带型码后，按照染色体1A、1B、1D、2A、2B、2D等顺序依次排列，建立小麦的分子身份证。

2 结果与分析

2.1 EST-SSR和STS分子标记的多态性分析

从192对引物中筛选出条带清晰、多态性丰富的21对引物。这些引物在8个小麦品种（系）中扩增出72个等位位点，每个引物扩增出的位点数2～7个，平均3.43个；基因多样性指数变幅为0.218 8～0.843 8，平均值为0.544 3，每个引物的多态性信息含量（PIC值）的变化范围在0.194 8～0.824 7 之间，平均值0.495 7（表1）。在这21对引物中，有6对引物检测到2个等位变异位点，有6对引物检测到3个等位变异位点，有5对引物检测到4个等位变异位点，有3对引物检测到5个等位变异位点，有1对引物检测到7个等位变异位点。

2.2 基于EST-SSR和STS分子标记构建小麦品种的分子身份证

以BNS作为对照种，21对引物对BNS扩增出来的带型都标记为1，获得这些引物对其他品种扩增的带型码。以引物SWES131（图1）为例，第1条泳道BNS扩增出的带型标记为1；第2条泳道周麦18扩增出的带型与BNS的带型不同，标记为2；第3、4、5、8条泳道分别是川麦107、新春6号、浙丰2号、小冰麦33扩增出的带型，与周麦18扩增的带型相同，同样标记为2；第6、7条泳道分别是CL0433、财富麦（FRA01）扩增的带型，与前2种带型都不同，标记为3。依此类推，得到引物SWES131在8个小麦品种（系）中扩增的带型码是12222332，然后获得21对引物在8个小麦品种（系）中扩增的带型码标记。同一品种在不同引物中扩增的带型码标记按照引物所在染色体1A、1B、1D、2A、2B、2D等顺序依次排列，获得1组由21个数字组成的分子身份证号，如川麦107的分子身份证号是：212222113331112121233，该分子身份证号的第1位数字2表示川麦107在引物SWES131上扩增的带型标记为2，第2位数字1表示在引物CFE150上扩增的带型标记为1（即与对照种的带型码相同），第3位数字2表示在引物CFE136上扩增的带型标记为2，后面的依此类推，获得8个小麦品种（系）的分子身份证号（表2）。

3 讨论

分子ID（即分子身份证） 是把品种的特征数字化，即每个品种都有属于自己的1套字符串形式的代码，从而可以简单明了地区分品种。构建小麦分子身份证，就需要选择具有条带清晰、多态性丰富、稳定性好等特点的引物，并选择合适的分子标记方法。随着分子标记的不断发展，农作物在分子水平上的研究越来越深入[13-14]，但是由于小麦是异源六倍体，分子水平上的研究相对落后于水稻、玉米等农作物，其完整的遗传图谱尚未完成。虽然小麦的分子标记很多，但是它们在染色体上的分布不均匀，要想构建完整的遗传图谱需要不断地开发新的分子标记，采用不同的分子标记相结合的方法构建。本研究利用覆盖小麦整个基因组的19对EST-SSRs引物和2对STS引物，以小麦低温敏雄性不育系BNS为对照种，构建杂交小麦亲本分子身份证。从结果中可以看出，引物SWES33、CFE11、CFE188、CFE138扩增出来的带型多，易于品种的鉴定和区分，其中引物SWES33和CFE11结合起来，可以将这8个小麦品种区分开，这为BNS型杂交小麦品种的鉴定工作提供了依据，有利于区分不同的品种，辨别假冒种子，防止假冒种子流入市场，维护消费者权益。

本研究中，记录带型数据主要是依靠人工对比获得，可能结果中存在一定的误差。随着科技的迅速发展，扩增产物可以借助基因分析仪进行直接读取[15-16]，构建更为精确的结果，但是该方法成本昂贵。另外，本研究只是针对8个代表性的杂交小麦亲本品种进行初步的探讨，以后还须对更多的杂交小麦亲本构建分子身份证，并结合田间农艺性状、商品信息等，使小麦品种有完善的数据库，为品种区分提供更为便利的方法，也将为杂交新品种的选育提供理论基础，推进杂交小麦育种的进程。

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