宁夏水稻品种抗稻瘟病基因Pi—ta、Pi—b和Pi9的检测分析

张银霞+张敏+田蕾+杨淑琴+李培富

摘要：为明确宁夏水稻品种中抗稻瘟病基因Pi-ta、Pi-b和Pi9的分布情况，为宁夏水稻抗穗颈瘟病的分子标记辅助选择育种奠定基础。利用Pi-ta、Pi-b和Pi9 3个与抗稻瘟病基因紧密连锁的功能标记，对94份宁夏水稻品种进行抗稻瘟病基因的分子检测。结果表明，宁夏水稻品种中含Pi-ta抗性基因的占46.8%，含Pi-b抗性基因的占93.6%，含Pi9抗性基因的占27.7%，同时含有Pi-ta和Pi-b抗性基因的占44.7%，同时含有Pi-ta、Pi-b和Pi9抗性基因的占12.8%。根据报道，Pi-ta、Pi-b基因的联合效应与穗颈瘟抗性正相关系数为0.71，表明从宁夏水稻品种中选育抗穗颈瘟品种是有基因基础的。

关键词：水稻品种；稻瘟病；穗颈瘟；Pi-ta基因；Pi-b基因；Pi9基因；抗病基因

中图分类号： S435.111.4+1 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）09-0035-04

水稻（Oryza sativa）是世界上最重要的粮食作物之一，其产生的稻谷是全球半数以上人口的主食。由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae；无性态：Pyriculariagrisea）引起的稻瘟病是水稻生产的主要病害之一[1]，严重威胁世界的粮食安全[2-3]。实践证明，利用抗稻瘟病基因培育抗性品种是防治水稻稻瘟病最经济、最有效、最环保的手段[4]。

宁夏是我国北方粳稻主产区之一，有悠久的水稻栽培历史，形成了独特而丰富的水稻遗传资源。近年来，随着全球气候变暖，稻瘟病的发生越来越严重，成为宁夏水稻的常发性病害，也是制约宁夏灌区水稻增产的主要病害，每年都有不同程度的发生，主要以穗颈瘟危害为主，尤其是2006—2007年，局部地区甚至有大发生[5]。然而，这些种质资源却没能得到充分利用，其原因首先是这些种质资源的抗稻瘟病基因类型和抗性尚不清楚；其次是常规育种法通常是在抗病性由主效基因控制时才是最有效的，并且存在效率低、工作量大、操作困难等缺点。

近年发展起来的分子标记技术可快速、准确地鉴定出材料中所含的抗性基因类型，并利用与稻瘟病抗性基因紧密连锁的分子标记进行分子标记辅助选择育种，这对于培育抗稻瘟病水稻品种有重要意义。目前已定位的抗稻瘟病基因至少有68个位点，总共有83个主效基因，它们成簇地分布在除第3染色体外的所有水稻染色体上[6]，已经有叶瘟、颈瘟、苗瘟共24个抗稻瘟病基因被克隆（根据中国水稻数据中心提供的资料），与其紧密连锁或共分离的分子标记多数都已被开发出来。本研究利用对穗颈瘟抗性贡献较大且相关性较紧密的抗稻瘟病基因Pi-ta、Pi-b、Pi9的紧密连锁的分子标记[7-9]对宁夏水稻品种的抗病基因进行分子检测与分析，旨在研究这3个抗性基因在宁夏水稻品种中的分布情况，为通过分子标记辅助选择育种技术培育抗穗颈瘟的水稻新品种提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

选用由宁夏大学、宁夏农业科学院等选育出的94份水稻品种作为供试材料：农科843、宁粳3号、宁粳7号、宁粳9号、宁粳12、宁粳15（作）、宁粳16、宁粳18（作）、宁粳19（作）、宁粳23（作）、宁粳25（作）、宁粳26（作）、宁粳27（作）、宁粳28、宁粳29、宁粳31（作）、宁粳32（作）、宁粳33（作）、宁粳34、宁粳35、宁粳36、宁粳37、宁粳38、宁粳39（作）、宁粳40、宁粳41、宁粳42（作）、宁粳43（李）、宁粳44、宁粳45、宁粳46、宁粳47（节7）、宁稻216、宁香稻1号、宁香稻2号、宁香稻3号、宁香优2号、京宁2号、京宁3号、京宁6号、京宁7号、宁资218、宁资460、节9、节12、花92、花96、花98、花117（作）、中花17、鉴17、鉴1310、鉴1320、鉴11、鉴61、鉴24、鉴1342、鉴1346、鉴1360、2007-218、2009XE-588、2001QX-62、2011-173、2012-731、2012-151、2012-162、2012-336、2012.784（航）、2013-1、2013-409、2013P2-36、2013-1104、2013-1120、2013-1134、11NX-2417、11NX-2324、318、05P3、SD-3、SD-4、毛毛糯、宁糯5号、黑兰稻、小糯稻、养和白皮大稻、大白芒稻、叶盛大皮大稻、小红板稻、小琥板稻、有芒小琥板稻、小白板稻、有芒大琥板稻、大琥板稻、白皮小稻。

1.2 试验方法

1.2.1 引物合成 PCR特异性引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列见表1。

1.2.2 基因组总DNA的提取 利用SDS法提取总DNA，并用琼脂糖电泳检测DNA的质量。以总DNA为模板，按下列反应体系（20 μL）进行PCR扩增：2.0 μL 10×缓冲液（含Mg2+）、0.4 μL dNTP（2.5 mmol/μL）、每种引物各1.0 μL （2 mmol/L）、0. 2 μL Taq酶、2.0 μL 模板DNA，用ddH2O补足至20 μL。PCR反应程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，退火（温度依据引物说明而定），72 ℃ 1.5 min，35个循环；72 ℃10 min。扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶中电泳，核酸染料染色，紫外灯下观察拍照。

2 结果与分析

2.1 Pi-ta、Pi-b和Pi9基因功能标记的检测和验证

利用Pi-ta、Pi-b和Pi9抗性基因的功能标记特异性PCR引物对94份宁夏水稻品种进行抗病基因检测。图1为Pi-ta基因的检测结果，可以看出，携带Pi-ta抗性基因的品种利用Pi-ta引物YL183/YL87能扩增出1 042 bp的片段，不含抗性基因Pi-ta的不能扩出1 042 bp的片段。图2为Pi-b基因的检测结果，可以看出，携带Pi-b抗性基因的品种利用Pi-b引物Lys145能扩增出803 bp的片段。图3为Pi9基因的检测结果，可以看出，携带Pi9抗性基因的品种利用Pi9引物M-Pi9能扩增出291 bp的片段，不携带Pi9抗性基因的品种扩增出的片段为397 bp。

2.2 宁夏水稻品种抗稻瘟病基因分子检测结果

通过对宁夏水稻品种抗稻瘟病基因的分子检测，表2结果表明：94份宁夏水稻品种中含有Pi-ta抗性基因的有44份，占46.8%，根据报道，Pi-ta抗性基因与抗穗颈瘟有正相关关系[7，13]，在宁夏水稻品种中含有Pi-ta抗性基因占46.8%，说明从宁夏当地品种中培育抗穗颈瘟的品种是有基因基础的；含有Pi-b抗性基因的有88份，占93.6%，说明宁夏水稻品种中大多数都含有Pi-b基因；含有Pi9抗性基因的有26份，占27.7%，Pi9抗性基因为光谱抗性基因，而在宁夏水稻品种中单独含Pi9抗性基因的材料较少。94份材料中同时含有Pi-ta和Pi-b抗性基因的有42份，占44.7%，根据报道，Pi-ta、Pi-b基因的联合效应与穗颈瘟抗性正相关系数为0.71[7，13]。因此，携带这2个抗病基因可以大大提高穗颈瘟抗性，这也说明从宁夏当地品种中培育抗穗颈瘟的品种是有基因基础的。由表2还可见，同时含有Pi-ta和Pi9抗性基因的有14份，占14.9%；同时含有Pi-b和Pi9抗性基因的有23份，占24.5%；同时含有Pi-ta、Pi-b和Pi9抗性基因的有12份，占12.8%。

3 讨论与结论

由于稻瘟病的发生逐年在增加，尤其是穗颈瘟危害最为严重，严重时可导致颗粒无收[14]。而近几年发展的通过分子标记辅助选择育种（MASB）在水稻抗稻瘟病育种上应用回交转移抗性基因并进行多个抗性基因的聚合，从而达到增加品种的抗性和抗谱，培育出多抗品种的事例越来越多，比如董巍等通过MASB方法将供体BL6的Pi1、Pi2抗性基因聚合到培矮64S水稻品种中，筛选出10株对稻瘟病的叶瘟和穗颈瘟抗性明显增强的改良株系[15]。表明多个抗性基因聚合后，抗性基因之间表现为极显著的基因互作，协同抵抗单个抗病基因不能抵抗的生理小种[16]，这是多基因聚合后抗谱拓宽、抗性增强的重要原因，因此基因聚合是培育稻瘟病持久抗性的有效方法。在聚合杂交中，应用目标性状紧密连锁的分子标记进行辅助选择，可以快速准确地将多个目标基因聚合于一个重组体。比如王军等研究表明，Pi-ta、Pi-b基因的联合效应与穗颈瘟抗性呈正相关，并且这种相关性比Pi-ta和Pi-b单独存在与穗颈瘟抗性的相关性要紧密[7]。

本研究应用3个抗稻瘟病基因紧密连锁的分子标记对宁夏水稻品种进行检测，结果表明，46%的宁夏水稻品种中含有抗稻瘟病基因Pi-ta，而Pi-ta基因与穗颈瘟抗性的相关性为0.5[7]；44%的宁夏水稻品种中含有抗稻瘟病基因Pi-ta和Pi-b，而这2种基因与穗颈瘟抗性的相关性为0.7[13，7]，所以这2种抗性基因的存在，可以为宁夏水稻选育抗穗颈瘟品种奠定基因基础。Pi9为广谱抗性的基因[17]，而宁夏水稻品种中缺乏Pi9基因，若以此为主效基因，可以聚合其他抗性基因以拓宽抗谱、提高持久抗稻瘟病的能力。目前在宁夏地区最严重的稻瘟病危害为穗颈瘟，可以利用品种中含有Pi-ta基因的品种与其他品种进行MASB，选育抗穗颈瘟的品种。所以本研究为宁夏水稻抗稻瘟病以及抗穗颈瘟的分子标记辅助育种奠定了基础。

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